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藥品質(zhì)量檢測方法之高效液相色譜法
2022年08月29日 11:20:30
來源：化工儀器網(wǎng) 作者：吳吳吳 點擊量：8487
近期，化工儀器網(wǎng)編輯整理了一系列藥品質(zhì)量檢測方法，本文將從儀器要求、系統(tǒng)適用性試驗、測定方法以及多維液相色譜四個方面為大家介紹藥品質(zhì)量檢測方法之高效液相色譜法。
【化工儀器網(wǎng) 行業(yè)百態(tài)】藥品是一種特殊的商品，它可以用于人疾病的預(yù)防、治療以及診斷，藥品的質(zhì)量關(guān)系著人民群眾的生命健康。藥品質(zhì)量檢測是指借助一定檢測手段，對藥物進行鑒別、含量測定以及進行有效性、均一性、純度要求與安全檢查，并將結(jié)果與規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較，最終判斷被測藥物是否符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一種質(zhì)量控制活動。
根據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》，藥品檢測方法主要包括儀器分析方法、物理常數(shù)測定方法、生物檢查法、分子生物學(xué)檢查法、其他測定方法等。近期，化工儀器網(wǎng)編輯整理了一系列藥品質(zhì)量檢測方法，本文將從儀器要求、系統(tǒng)適用性試驗、測定方法以及多維液相色譜四個方面為大家介紹藥品質(zhì)量檢測方法之高效液相色譜法。
高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。
一、對儀器的一般要求和色譜條件
高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱內(nèi)徑一般為 2.1~4.6mm，填充劑粒徑約為 2~10μm。超高效液相色譜儀是耐超高壓、小進樣量、低死體積、高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。
1、色譜柱
?、俜聪嗌V柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復(fù)合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。
②正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。
③離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。
?、苁中苑蛛x色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。
色譜柱的內(nèi)徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、載體表面基團殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應(yīng)根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì)來選擇合適的色譜柱。
溫度會影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應(yīng)注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當(dāng)調(diào)整色譜柱的溫度。
殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱，流動相pH值一般應(yīng)在2-8之間。烷基硅烷帶有立體側(cè)鏈保護、或殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復(fù)合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛pH值的流動相，可用于 pH 值小于 2 或大于 8 的流動相。
2、檢測器
最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。
紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)，還與其結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器和示差折光檢測器為通用檢測器，對所有物質(zhì)均有響應(yīng)；結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)在蒸發(fā)光散射檢測器和電霧式檢測器的響應(yīng)值幾乎僅與被測物質(zhì)的量有關(guān)。
紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器和示差折光檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系；蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量通常呈指數(shù)關(guān)系，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換；電霧式檢測器的響應(yīng)值與被測物質(zhì)的量通常也呈指數(shù)關(guān)系，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換或用二次函數(shù)計算，但在小質(zhì)量范圍內(nèi)可基本呈線性。
不同的檢測器，對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應(yīng)符合紫外-可見分光光度法(通則 0401)項下對溶劑的要求；釆用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機溶劑的截止使用波長。蒸發(fā)光散射檢測器、電霧式檢測器和質(zhì)譜檢測器不得使用含不揮發(fā)性成分的流動相。
3、流動相
反相色譜系統(tǒng)的流動相常用甲醇-水系統(tǒng)或乙腈-水系統(tǒng)，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統(tǒng)。流動相中如需使用緩沖溶液，應(yīng)盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般應(yīng)不低于 5%，否則易導(dǎo)致柱效下降、色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。
正相色譜系統(tǒng)的流動相常用兩種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。
流動相注入液相色譜儀的方式(又稱洗脫方式)可分為兩種：一種是等度洗脫，另一種是梯度洗脫。用梯度洗脫分離時，梯度洗脫程序通常以表格的形式在品種項下規(guī)定，其中包括運行時間和流動相在不同時間的成分比例。
4、色譜參數(shù)調(diào)整
品種正文項下規(guī)定的色譜條件(參數(shù))，除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當(dāng)調(diào)整。
若需使用小粒徑(約 2µm)填充劑和小內(nèi)徑(約 2.1mm)色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時間，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配，必要時，色譜條件(參數(shù))可適當(dāng)調(diào)整。
可通過相關(guān)軟件計算表中流速、進樣體積和梯度洗脫程序的調(diào)整范圍，并根據(jù)色譜峰分離情況進行微調(diào)。
調(diào)整后，系統(tǒng)適用性應(yīng)符合要求，且色譜峰出峰順序不變。若減小進樣體積，應(yīng)保證檢測限和峰面積的重復(fù)性；若增加進樣體積，應(yīng)使分離度和線性關(guān)系仍滿足要求。應(yīng)評價色譜參數(shù)調(diào)整對分離和檢測的影響，必要時對調(diào)整色譜參數(shù)后的方法進行確認。若調(diào)整超出表中規(guī)定的范圍或品種項下規(guī)定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進行充分的方法學(xué)驗證。
調(diào)整梯度洗脫色譜參數(shù)時應(yīng)比調(diào)整等度洗脫色譜參數(shù)時更加謹(jǐn)慎，因為此調(diào)整可能會使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰重疊。
當(dāng)對調(diào)整色譜條件后的測定結(jié)果產(chǎn)生異議時，應(yīng)以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。
在品種項下一般不宜指定或推薦色譜柱的品牌，但可規(guī)定色譜柱的填充劑(固定相)種類(如鍵合相，是否改性、封端等)、粒徑、孔徑，色譜柱的柱長或柱內(nèi)徑；當(dāng)耐用性試驗證明必須使用特定品牌的色譜柱方能滿足分離要求時，可在該品種正文項下注明。
二、系統(tǒng)適用性試驗
色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等五個參數(shù)。
按各品種正文項下要求對色譜系統(tǒng)進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進行適當(dāng)調(diào)整，以符合要求。
1、色譜柱的理論板數(shù)（n）：用于評價色譜柱的效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量色譜柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測物質(zhì)或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。
在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰的保留時間 tR 和峰寬(W)或半高峰寬(Wh/2)，按 n=16(tR/W)2 或 n=5.54(tR/Wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。tR、W、Wh/2可用時間或長度計(下同)，但應(yīng)取相同單位。
2、分離度（R）：用于評價待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)。可以通過測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度，也可以通過測定待測物質(zhì)與某一指標(biāo)性成分(內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì))的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)?shù)姆椒ń到猓ㄟ^測定待測物質(zhì)與某一降解產(chǎn)物的分離度，對色譜系統(tǒng)分離效能進行評價與調(diào)整。
無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質(zhì)色譜峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)色譜峰或特定的雜質(zhì)對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)不小于 1.5。分離度的計算公式為：
當(dāng)對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)(n)和分離度(R)均以峰寬(W)的計算結(jié)果為準(zhǔn)。
3、靈敏度：用于評價色譜系統(tǒng)檢測微量物質(zhì)的能力，通常以信噪比（S/N）來表示。建立方法時，可通過測定一系列不同濃度的供試品或?qū)φ掌啡芤簛頊y定信噪比。定量測定時，信噪比應(yīng)不小于 10；定性測定時，信噪比應(yīng)不小于 3。系統(tǒng)適用性試驗中可以設(shè)置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統(tǒng)的檢測能力。
4、拖尾因子（T）：用于評價色譜峰的對稱性。拖尾因子計算公式為：
以峰高作定量參數(shù)時，除另有規(guī)定外，T 值應(yīng)在 0.95~1.05 之間。
以峰面積作定量參數(shù)時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴(yán)重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準(zhǔn)確性，此時應(yīng)在品種正文項下對拖尾因子作出規(guī)定。
5、重復(fù)性：用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進樣時響應(yīng)值的重復(fù)性能。除另有規(guī)定外，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進樣 5 次，其峰面積測量值(或內(nèi)標(biāo)比值或其校正因子)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于 2.0%。視進樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應(yīng)和分析方法所能達到的精度水平等，對相對標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求可適當(dāng)放寬或收緊，放寬或收緊的范圍以滿足品種項下檢測需要的精密度要求為準(zhǔn)。
三、測定方法
1、定性分析
常用的定性方法主要有但不限于利用保留時間定性、利用光譜相似度定性、利用質(zhì)譜檢測器提供的質(zhì)譜信息定性幾種。
①利用保留時間定性
保留時間(retention time，tR)定義為被分離組分從進樣到柱后出現(xiàn)該組分最大響應(yīng)值時的時間，也即從進樣到出現(xiàn)某組分色譜峰的頂點時為止所經(jīng)歷的時間，常以分鐘(min)為時間單位，用于反映被分離的組分在性質(zhì)上的差異。通常以在相同的色譜條件下待測成分的保留時間與對照品的保留時間是否一致作為待測成分定性的依據(jù)。
在相同的色譜條件下，待測成分的保留時間與對照品的保留時間應(yīng)無顯著性差異；兩個保留時間不同的色譜峰歸屬于不同化合物，但兩個保留時間一致的色譜峰有時未必可歸屬為同一化合物，在作未知物鑒別時應(yīng)特別注意。
若改變流動相組成或更換色譜柱的種類，待測成分的保留時間仍與對照品的保留時間一致，可進一步證實待測成分與對照品為同一化合物。
當(dāng)待測成分(保留時間 tR，1)無對照品時，可以樣品中的另一成分或在樣品中加入另一已知成分作為參比物(保留時間 tR，2)，采用相對保留時間(RRT)作為定性(或定位)的方法。在品種項下，除另有規(guī)定外，相對保留時間通常是指待測成分保留時間相對于主成分保留時間的比值，以未扣除死時間的非調(diào)整保留時間按下式計算。
若需以扣除死時間的調(diào)整保留時間計算，應(yīng)在相應(yīng)的品種項下予以注明。
②利用光譜相似度定性
化合物的全波長掃描紫外-可見光區(qū)光譜圖提供一些有價值的定性信息。待測成分的光譜與對照品的光譜的相似度可用于輔助定性分析。二極管陣列檢測器開啟一定波長范圍的掃描功能時，可以獲得更多的信息，包括色譜信號、時間、波長的三維色譜光譜圖，既可用于輔助定性分析，還可用于峰純度分析。
同樣應(yīng)注意，兩個光譜不同的色譜峰表征了不同化合物，但兩個光譜相似的色譜峰未必可歸屬為同一化合物。
③利用質(zhì)譜檢測器提供的質(zhì)譜信息定性
利用質(zhì)譜檢測器提供的色譜峰分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)的信息進行定性分析，可獲得比僅利用保留時間或增加光譜相似性進行定性分析更多的、更可靠信息，不僅可用于已知物的定性分析，還可提供未知化合物的結(jié)構(gòu)信息。
2、定量分析
①內(nèi)標(biāo)法
按品種正文項下的規(guī)定，精密稱(量)取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，各精密量取適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進樣，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，進樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：
采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。
?、谕鈽?biāo)法
按各品種項下的規(guī)定，精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，進樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質(zhì)的峰面積(或峰高)，按下式計算含量：
式中各符號意義同上。
當(dāng)采用外標(biāo)法測定時，以手動進樣器定量環(huán)或自動進樣器進樣為宜。
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測定雜質(zhì)含量時，可釆用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱(量)取待測物對照品和參比物質(zhì)對照品各適量，配制待測雜質(zhì)校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按下式計算待測雜質(zhì)的校正因子。
也可精密稱(量)取主成分對照品和雜質(zhì)對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進樣，記錄色譜圖，繪制主成分濃度和雜質(zhì)濃度對其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質(zhì)回歸直線斜率的比計算校正因子。
校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積，需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參比，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。
測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤?，作為對照溶液，進樣，記錄色譜圖，必要時，調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍(以噪聲水平可接受為限)使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的 10%~25%。除另有規(guī)定外，通常含量低于 0.5%的雜質(zhì)，峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)小于 10%；含量在 0.5%~2%的雜質(zhì)，峰面積測量值的 RSD 應(yīng)小于 5%；含量大于 2%的雜質(zhì)，峰面積測量值的 RSD 應(yīng)小于 2%。然后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質(zhì)含量。
④不加校正因子的主成分自身對照法
測定雜質(zhì)含量時，若無法獲得待測雜質(zhì)的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述(3)法配制對照溶液、進樣、調(diào)節(jié)縱坐標(biāo)范圍和計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣。除另有規(guī)定外，供試品溶液的記錄時間應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的 2 倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算雜質(zhì)含量。
⑤面積歸一化法
按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量進樣，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時，由于儀器響應(yīng)的線性限制，峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。
如適用，也可使用其他方法如標(biāo)準(zhǔn)曲線法等，并在品種正文項下注明。
四、多維液相色譜
多維色譜又稱為色譜/色譜聯(lián)用技術(shù)，是采用匹配的接口將不同分離性能或特點的色譜連接起來，第一級色譜中未分離開或需要分離富集的組分由接口轉(zhuǎn)移到第二級色譜中，第二級色譜仍需進一步分離或分離富集的組分，也可以繼續(xù)通過接口轉(zhuǎn)移到第三級色譜中。理論上，可以通過接口將任意級色譜串聯(lián)或并聯(lián)起來，直至將混合物樣品中所有的難分離、需富集的組分都分離或富集之。但實際上，一般只要選用兩個合適的色譜聯(lián)用就可以滿足對絕大多數(shù)難分離混合物樣品的分離或富集要求。因此，一般的色譜/色譜聯(lián)用都是二級，即二維色譜。
在二維色譜的術(shù)語中，1D 和 2D 分別指一維和二維；而 1D 和 2D 則分別代表第一維和第二維。
二維液相色譜可以分為差異顯著的兩種主要類型：中心切割式二維色譜(heart-cutting mode two-dimensional chromatography)和全二維色譜(comprehensive two-dimensional chromatography)。中心切割式二維色譜是通過接口將前一級色譜中某一(些)組分傳遞到后一級色譜中繼續(xù)分離，一般用 LC-LC(也可用 LC+LC)表示；全二維色譜是通過接口將前一級色譜中的全部組分連續(xù)地傳遞到后一級色譜中進行分離，一般用 LC×LC 表示。此外，這兩種類型下還有若干子類，包括選擇性全二維色譜(sLC×LC)和多中心切割 2D-LC(mLC-LC)。
LC-LC 或 LC×LC 兩種二維色譜可以是相同的分離模式和類型，也可以是不同的分離模式和類型。接口技術(shù)是實現(xiàn)二維色譜分離的關(guān)鍵之一，原則上，只要有匹配的接口，任何模式和類型的色譜都可以聯(lián)用。
與一維色譜一樣，二維色譜也可以和質(zhì)譜、紅外和核磁共振等聯(lián)用。
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