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ELISA實驗樣本中動物肝臟DNA的提取與純化
閱讀：1081 發(fā)布時間：2016-1-13原理
生物體組織細(xì)胞中的大部分脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）與蛋白質(zhì)結(jié)合，以核蛋白——脫氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，這兩類中復(fù)合物再不同的電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。在低濃度的NaCl溶液中，DNP的溶解度隨NaCl濃度的增加而逐漸降低，當(dāng)NaCl濃度達到0.14mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的1%（幾乎不溶）；但當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高時，DNP的溶解度又逐漸增大，當(dāng)NaCl濃度增至0.5mol/L時，DNP的溶解度約為純水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP則不一樣，它在弄NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同濃度的NaCl溶液將DNP和RNP分別抽提出來。
將抽提得到的DNP用十二烷基硫酸鈉（SDS）處理，DNA即與蛋白質(zhì)分開，可用氯仿-異丙醇將蛋白質(zhì)沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入適量的乙醇，DNA即析出，進一步脫水干燥，既得白色纖維狀的DNA粗制品。為了防止DNA（或RNA）酶解，提取時加入乙二胺四乙酸（EDTA）。大部分多糖在用乙醇或異丙醇分級沉淀時即可除去。
方法
1、DNA的提?。?/p>
a.稱取新鮮動物的肝臟（如豬肝）約10g，于研缽中，在冰浴中剪碎，加2倍組織重的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液（約20ml）研磨成漿狀，得勻漿液。
b.將勻漿液（除去組織碎片）于3000r/min離心10分鐘，棄去上清液，收集沉淀（內(nèi)含DNP），沉淀中加兩倍體積的冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，攪勻，如前離心，重復(fù)洗滌2~3次。所得沉淀為DNP粗制品，移至燒杯中。
2、DNA的純化：
a.取粗品DNA，加入5μl RNA酶，用玻璃棒慢慢攪拌20分鐘。
b.向沉淀中加入冷的0.14mol/L NaCl 0.15mol/L EDTA溶液，使總體積達到20ml，在緩慢攪拌的同時滴加25%的SDS溶液1.5ml，邊加邊攪拌，此步驟使核酸與蛋白質(zhì)分離。
c.加入2mol/L NaCl溶液 5ml，使NaCl終濃度為1mol/L，攪拌10分鐘（速度要慢）。溶液變得黏稠并略帶透明。
d.加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇混合液，于冰浴中攪拌20分鐘，3000r/min離心10分鐘。分層，上層為水相（含DNA鈉鹽），中層為變性的蛋白沉淀，下層為苯酚/氯仿/異戊醇混合液。
e.用吸管小心地吸取上層水相，棄去沉淀，再在相同條件下重復(fù)抽提2~3次。
f.取上清液放入干燥小燒杯中，加入2倍體積預(yù)冷的95%乙醇。加乙醇時，用滴管吸取乙醇，邊加邊用玻璃棒慢慢順一個方向在燒杯內(nèi)轉(zhuǎn)動，隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現(xiàn)黏稠狀物質(zhì)，并能逐步纏繞與玻璃棒上，此時玻璃棒攪動的目的在于把黏稠絲狀物纏在玻璃棒上，直至再無黏稠絲狀物出現(xiàn)為止。黏稠絲狀物即是DNA。
g.用2ml 80%乙醇洗滌沉淀物1次。
h.室溫干燥，直到附于玻璃棒的殘余液滴干凈。
i.用1~2ml TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
注意事項
1、選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不宜過長。
2、提取和純化的DNA不純，加溶解液大少使?jié)舛冗^大，或者沉淀物太干燥，這些因素都會導(dǎo)致提取的DNA不易溶解。
3、苯酚/氯仿/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取，表明含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。