熱賣細胞,Nthy-ori 3-1細胞,人正常甲狀腺細胞
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- 更新時間 2017/4/21 22:17:40
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產品名稱:熱賣細胞,Nthy-ori 3-1細胞,人正常甲狀腺細胞
細胞規(guī)格:株
質控標準:無支原體、無污染、符合標準
運輸方式:新鮮運輸和凍存管運輸
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,質粒的相關知識:
一.如何閱讀質粒圖譜
*步:首先看 Ori 的位置,了解質粒的類型(原核/真核/穿梭質粒)。
第二步:再看篩選標記,如抗性,決定使用什么篩選標記。
--Ampr 水解β-內酰胺環(huán),解除氨芐的毒性;
--tetr 可以阻止四環(huán)素進入細胞;
--camr 生成氯霉素羥乙?;苌铮怪ザ拘?;
--neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418(長那霉素衍生物)失活;
--hygr 使潮霉素β失活。
第三步:看多克隆位點(MCS)。它具有多個限制酶的單一切點,便于外源基因的插入。如果在這些位點外有外源基因的插入,會導致某種標志基因的失活,從而便于篩選。MCS決定了能不能放置目的基因以及如何放置目的基因。
第四步:再看外源DNA插入片段大小。質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA段。一般來說,外源DNA段越長,越難插入,越不穩(wěn)定,轉化效率越低。
第五步:是否含有表達系統(tǒng)元件,即啟動子-核糖體結合位點-克隆位點-轉錄終止信號,這是用來區(qū)別克隆載體與表達載體。在克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。選用哪種載體,要以實驗目的為依據(jù)。
二.如何選擇載體
把目的基因通過基因工程手段送到生物細胞(受體細胞),需要運載工具(交通工具)攜帶外源基因進入受體細胞,這種運載工具就叫做載體(vector)?;蚬こ趟玫膙ector實際上是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。
選擇載體主要依據(jù)構建的目的,同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構建的目的是要表達一個特定的基因,則要選擇合適的表達載體。
,載體選擇主要考慮下述3點:
1. 構建DNA重組體的目的:克隆載體/表達載體。
2. 載體的類型:
克隆載體的克隆能力:根據(jù)克隆片段大?。ù筮x大,小選?。?。如<10kb選質粒。
表達載體:根據(jù)受體細胞類型:原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳類細胞表達載體。
原核表達載體要選擇合適的啟動子及相應的受體菌;表達真核蛋白時需注意閱讀框錯位問題;表達天然蛋白和融合蛋白所需載體亦有區(qū)別。
3. 選用質粒做載體的4點要求:
(1)選分子量小的質粒,即小載體(1-1.5kb):不易損壞,在細菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);
(2)一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束,一般10個以上的拷貝,而嚴謹型質粒<10個。
(3)必需具備一個以上的酶切位點,有選擇的余地;
(4)必需有易檢測的標記,多是抗生素的抗性基因。
無論選用哪種載體,首先都要獲得載體分子,然后采用適當?shù)南拗泼笇⑤d體DNA進行切割,獲得載體片段,以便于與目的基因片段進行連接。
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