10912ES10 多片段一步法快速克隆試劑盒
- 公司名稱 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
- 品牌 Yeasen/翌圣生物
- 型號 10912ES10
- 產(chǎn)地 上海
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時間 2025/2/7 13:39:41
- 訪問次數(shù) 3710
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企業(yè)簡介
翌圣生物科技（上海）股份有限公司【Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.】是一家以蛋白質(zhì)改造和酶進(jìn)化技術(shù)為驅(qū)動，聚焦生命科學(xué)產(chǎn)業(yè)鏈上游核心原料，從事分子、蛋白和細(xì)胞三大品類生物試劑的研發(fā)、生產(chǎn)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)，通過打通分子酶、蛋白、抗體、核酸、細(xì)胞的技術(shù)開發(fā)路徑，成為國內(nèi)少數(shù)同時覆蓋三大品類生物試劑、兼?zhèn)浜诵募夹g(shù)自主研發(fā)能力和規(guī)模化生產(chǎn)能力的高新技術(shù)企業(yè)，產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域、診斷與檢測領(lǐng)域和生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
主營業(yè)務(wù)
公司憑借在蛋白質(zhì)改造和酶進(jìn)化領(lǐng)域的技術(shù)優(yōu)勢和深耕生物試劑行業(yè)多年積累的豐富經(jīng)驗，構(gòu)建了品質(zhì)優(yōu)良、類型齊全、種類豐富的產(chǎn)品管線。自公司成立以來，公司研發(fā)、生產(chǎn)和銷售的生物試劑超過3000種，涵蓋分子、蛋白、細(xì)胞三大品類的生物試劑，能夠滿足客戶多種類型生物試劑的一體化采購需求。公司核心產(chǎn)品覆蓋qPCR系列、NGS系列、逆轉(zhuǎn)錄系列、核酸提取與純化系列、PCR系列、分子克隆系列、體外轉(zhuǎn)錄系列、抗體、蛋白純化系列、蛋白分析系列、重組蛋白、細(xì)胞分析系列、細(xì)胞培養(yǎng)系列、細(xì)胞轉(zhuǎn)染系列、報告基因檢測系列等多個品類的生物試劑，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、診斷檢測和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域。
發(fā)展歷程
榮譽(yù)資質(zhì)
翌圣生物通過申請商標(biāo)和軟件著作權(quán)的方式保障核心技術(shù)和市場競爭力，不斷加強(qiáng)公司品牌建設(shè)。截至2022年3月31日，公司已經(jīng)獲得授權(quán)18項（其中發(fā)明14項、實用新型1項、外觀設(shè)計3項）和45項與生物試劑相關(guān)的軟件著作權(quán)，擁有經(jīng)國家知識產(chǎn)權(quán)局商標(biāo)局核準(zhǔn)的注冊商標(biāo)權(quán)37項以及4項境外注冊商標(biāo)，是國家高新技術(shù)企業(yè)和上海市專精特新企業(yè)。
創(chuàng)新平臺
經(jīng)過多年的產(chǎn)品研發(fā)技術(shù)經(jīng)驗的沉淀以及持續(xù)的研發(fā)創(chuàng)新，翌圣生物積極開展“產(chǎn)學(xué)研”合作，與擁有生物催化與酶領(lǐng)域國家重點實驗室的湖北大學(xué)、擁有教育部工業(yè)生物領(lǐng)域重點研究基地的江南大學(xué)展開合作，優(yōu)化生物試劑關(guān)鍵原料的生產(chǎn)和表達(dá)工藝。翌圣生物以基因工程技術(shù)、生物信息技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)、生化分析技術(shù)等生命科學(xué)領(lǐng)域的共性生物技術(shù)為基礎(chǔ)，建立了六大核心技術(shù)平臺——雙向分子酶理性設(shè)計與定向進(jìn)化平臺、密度發(fā)酵與超潔凈純化平臺、分子診斷試劑關(guān)鍵原料研發(fā)平臺、高通量測序建庫試劑創(chuàng)新研發(fā)平臺、高性能單克隆抗體研發(fā)平臺和mRNA醫(yī)藥應(yīng)用研發(fā)平臺，目前已經(jīng)自主研發(fā)出20項核心技術(shù)，打通分子酶、蛋白、抗體、核酸、細(xì)胞的技術(shù)開發(fā)路徑，覆蓋技術(shù)研發(fā)、產(chǎn)品升級、規(guī)模生產(chǎn)和質(zhì)量控制等生物試劑研發(fā)和生產(chǎn)的各關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
工業(yè)化生產(chǎn)
翌圣生物擁有按照準(zhǔn)GMP 標(biāo)準(zhǔn)建設(shè)運營的工業(yè)化生產(chǎn)基地，配有噸級發(fā)酵線、工業(yè)級 AKTA 純化線和全自動包裝線。同時，公司通過了ISO 13485:2016質(zhì)量管理體系認(rèn)證，從原料控制、生產(chǎn)管理、質(zhì)檢管控、倉儲運輸?shù)葘ιa(chǎn)線進(jìn)行360度管理監(jiān)督，保證產(chǎn)品過程的可控制性及可追溯性，竭盡全力為您提供可靠的產(chǎn)品。
客戶服務(wù)
翌圣生物憑借優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量、高效及時的響應(yīng)能力、快速穩(wěn)定的交付能力和周到完備的售后服務(wù)獲得了眾多科研用戶和工業(yè)用戶的認(rèn)可，為檢測公司、治療公司、工具類公司和科學(xué)研究實驗室提供應(yīng)用于科學(xué)研究、體外診斷、基因測序、生物醫(yī)藥等的生物試劑。與中國科學(xué)院、清華大學(xué)、北京大學(xué)、復(fù)旦大學(xué)、上海交通大學(xué)、浙江大學(xué)等頂尖科研院所和華大基因、恒瑞醫(yī)藥、藥明康德、之江生物、圣湘生物、斯微生物、金斯瑞、思路迪等工業(yè)客戶建立了穩(wěn)定、緊密的合作關(guān)系，公司產(chǎn)品被多次使用在Nature、Science、Cell等國際頂級期刊論文發(fā)表中。
公司企業(yè)文化
幫助客戶創(chuàng)造價值，讓世界更健康更快樂
◎ 成為生命科學(xué)工具領(lǐng)域全球Top⑩
◎ 具備驅(qū)動產(chǎn)業(yè)變革的技術(shù)創(chuàng)新能力
◎ 擁有一支持續(xù)學(xué)習(xí)型的翌圣鐵軍
翌圣生物始終秉承“幫助客戶創(chuàng)造價值，讓世界更健康更快樂”的使命，專注于技術(shù)創(chuàng)新和產(chǎn)品升級，不斷拓展核心技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域，為客戶提供更為的產(chǎn)品與服務(wù)，助力我國打造自主可控的生物試劑產(chǎn)業(yè)鏈。同時，翌圣生物將進(jìn)一步推進(jìn)國際化戰(zhàn)略，繼續(xù)布局和拓展海外市場，為全球生物試劑產(chǎn)業(yè)發(fā)展貢獻(xiàn)力量。
分子生物學(xué)試劑，細(xì)胞生物學(xué)試劑，免疫學(xué)試劑，蛋白組學(xué)試劑等
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 10 T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 10912ES10 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 儲存 | 價格（元） | *（元） |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆試劑盒 | 10912ES10 | 10 T | -20℃ | 457.00 |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit是一款簡便、快速、高效的DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點，可高效克隆50 bp-10 kb片段。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃反應(yīng)20 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。克隆陽性率可達(dá)95%以上。
試劑盒中2×Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液，并添加了*的重組增強(qiáng)因子，可顯著提高重組克隆效率。使用該試劑盒，可以一次實現(xiàn)多至5個片段的順序拼接克隆。
產(chǎn)品組分
編號 | 組分 | 10912ES10 (10 T) |
10912-A | 2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix | 100 μL |
10912-B | 500 bp Control Insert (25 ng/μL) | 5 μL |
10912-C | pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL |
快速克??；定向克隆；定點突變。
運輸與保存方法
冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。
注意事項
1）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
2）本產(chǎn)品僅作科研用途！
實驗流程
① 載體線性化：酶切或反向PCR制備線性化載體。
② 插入片段的制備：由PCR制備，所用擴(kuò)增引物在設(shè)計時需在其5’端添加同源序列（圖中以紅色、黃色、紫色和綠色標(biāo)記)，使得擴(kuò)增產(chǎn)物之間以及擴(kuò)增產(chǎn)物與線性化載體之間各有一段同源序列。
一. 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點，并對載體進(jìn)行線性化。建議盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。載體克隆位點上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴(kuò)增獲得。
1.酶切制備線性化載體
1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。
2）單酶切線性化：線性化程度較差?？蛇m當(dāng)延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。
【注】：不含插入片段的假陽性克隆是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。
2.反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體
建議使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）進(jìn)行載體擴(kuò)增，以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。
Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有酶切反應(yīng)體系和常規(guī)PCR反應(yīng)體系，當(dāng)載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較高時，可以無需純化，直接進(jìn)行重組反應(yīng)。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化載體進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。
二. PCR擴(kuò)增制備插入片段
1.設(shè)計擴(kuò)增引物
Hieff Clone® 引物設(shè)計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的*一致的序列。
推薦使用翌圣無縫克隆引物設(shè)計軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴(kuò)增引物。若手動設(shè)計，可參照以下實例。以在pUC18載體（注：與該試劑盒中提供的C組分不同，C組分為pUC19）的EcoR I 和Hind III 酶切位點間插入三段基因的引物設(shè)計為例，引物具體設(shè)計方案如下：
首先設(shè)計第一片段的正向擴(kuò)增引物和第三片段的反向擴(kuò)增引物(與載體相鄰的兩個插入片段)。
第一片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：
5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’
第三片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：
3’—第三片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+酶切位點（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’
【注】：
① 基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
② 上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。
其次設(shè)計第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物。用于片段之間進(jìn)行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴(kuò)增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴(kuò)增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向擴(kuò)增引物中為例，引物具體設(shè)計方案如圖3所示：
第一片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：
3’—第一片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式：
5’—第二片段基因特異性正向擴(kuò)增序列—3’
【注】：
① 基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；
② 第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進(jìn)行重組的添加序列。
最后設(shè)計第二片段的反向擴(kuò)增引物和第三片段的正向擴(kuò)增引物。設(shè)計方式與第一片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計方式一致。 
【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進(jìn)行引物合成。計算擴(kuò)增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
2.插入片段PCR擴(kuò)增
插入片段擴(kuò)增可用任意PCR酶擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴(kuò)增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。
PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如果擴(kuò)增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應(yīng)。但PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純度較低時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。
三. 線性化載體與插入片段濃度測定
推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對DNA進(jìn)行定量。將線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物做數(shù)個等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度。
四. 重組反應(yīng)
1. 線性化載體與插入片段使用量計算
Hieff Clone® Plus Multi重組反應(yīng)體系最適DNA使用量為每片段（包括線性化載體）0.03 pmoL。該摩爾數(shù)對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計算獲得：
每片段最適使用量= [0.02×載體堿基對數(shù)]ng (0.03 pmoL)
例如，將長度為0.5kb、1kb、2 kb三插入片段克隆至長度為5 kb的載體時，各片段最適使用量應(yīng)為：
線性化載體最適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng；
0.5kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 500 = 10 ng；
1 kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 1000 = 20 ng；
2 kb插入片段最適使用量應(yīng)為：0.02 × 2000 = 40 ng。
【注】：
1）插入片段DNA使用量應(yīng)大于10 ng。當(dāng)使用上述公式計算DNA最適使用量低于這個值時，直接使用10 ng即可。
2）線性化載體的使用量應(yīng)在50-200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計算最適使用量超出這個范圍時，則選擇低或高使用量即可。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。
2.反應(yīng)體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）
組分 | 重組反應(yīng) | 陰性對照-1 | 陰性對照-2 | 陽性對照 |
ddH2O | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL |
2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix | 10 μL | 0 μL | 0 μL | 10 μL |
線性化載體 | X μL | X μL | 0 μL | 1 μL |
N個插入片段 | Y μL | 0 μL | Y μL | 1 μL |
【注】：
1）X和Y分別是根據(jù)公式計算得到線性化載體和插入片段用量。
2）陰性對照-1可用來確認(rèn)線性化載體有無環(huán)狀質(zhì)粒殘留，可選擇性進(jìn)行。
3）當(dāng)插入片段擴(kuò)增模板是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒時，可用陰性對照-2來確認(rèn)有無環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留，可選擇性進(jìn)行。
4）試劑盒中提供陽性對照反應(yīng)所需組分（B組分和C組分），可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響，可選擇性進(jìn)行。
3.重組反應(yīng)
1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。
2）置于50℃反應(yīng)20 -50 min。當(dāng)插入片段總和＞5 kb時，建議提高孵育時間到30-50 min可以增大重組效率。
注：建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進(jìn)行反應(yīng)。
3）待反應(yīng)完成后，建議將反應(yīng)管置于冰上冷卻5 min，以防溫度過高降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。
4）反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。
五. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板
1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。
2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置30 min。
3）42℃熱激90秒，冰浴孵育2 min。
4）加入900 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育10 min充分復(fù)蘇。37℃，200 rpm，搖菌45 min。
5）5000 rpm離心3 min，棄掉900 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。
六. 克隆鑒定
方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進(jìn)行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。
應(yīng)用實例
圖4. Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit進(jìn)行三片段克隆。
A：重組轉(zhuǎn)化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重組反應(yīng)條件：50℃，20 min。
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