布魯氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）產(chǎn)品及特點(diǎn) 布魯氏菌（brucellosis）為病原微生物，是一種細(xì)胞內(nèi)寄生小球桿狀菌，革蘭氏染色陰性，主要感染牛、羊、豬、狗以及駱駝、鹿等動(dòng)物。布魯氏菌主要是通過接觸感染的動(dòng)物或者吃被感染的食物以及實(shí)驗(yàn)室接觸等方式傳播給人類，
能引起人和多種動(dòng)物的急性和慢急性疾病，被感染的人和動(dòng)物表現(xiàn)為流產(chǎn)及等癥狀。
布魯氏菌核酸檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）結(jié)合 Taqman 技術(shù)，對(duì)布魯氏菌的
特異性 DNA 核酸片段進(jìn)行熒光檢測(cè)，可用于臨床對(duì)布魯氏菌的輔助診斷，使用
方便，即開即用。血液、骨髓、關(guān)節(jié)腔液及病畜的組織、奶、奶制品均可作為本
試劑盒的檢測(cè)標(biāo)本。標(biāo)本可立即用于檢測(cè)，也可保存在-20℃待測(cè)。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)
在低溫條件下進(jìn)行。
規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 25 次塑料袋包裝
核酸提取液 11-4505A 1.5 mL×2
熒光 PCR Mix 11-4505B 950 μL
酶（Taq+UNG） 11-4505C 12 μL
超純水 100935 400 μL
內(nèi)部對(duì)照品 11-4505D 30 μL
陽(yáng)性對(duì)照品 11-4505E 30 μL
使用手冊(cè) 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限一年。
自備試劑 Hank’s 液（PBS 或生理鹽水）、血液分離液
使用方法 一、標(biāo)本、對(duì)照品的核酸裂解處理
1. 骨髓、關(guān)節(jié)腔液、血清等液態(tài)標(biāo)本：取 50 μL 樣本，加入 50 μL 核酸提取
液充分混勻，沸水浴 10 分鐘，然后 13,000 rpm 離心 10 分鐘，取上清 4
μL 作為 PCR 反應(yīng)模板。
2. 全血 PBMC 分離：取抗凝血 1 mL，與 Hank’s 液（PBS 或生理鹽水）1：
1 混勻后，小心加于 2 mL 的細(xì)胞分離液的液面上，2000 rpm 離心 15 分
鐘（半徑 15 cm 水平轉(zhuǎn)子），收集界面上的細(xì)胞（中間呈白色層），置于 1.5
mL eppendorf 管中，2000 rpm 離心 10 分鐘，棄上清液。沉淀中加入
50 μL 核酸提取液，振蕩 10 秒，99℃干浴或水浴 10 分鐘，13,000 rpm
離心 10 分鐘，保留上清備用。
3. 奶標(biāo)本：取奶 3 mL ，13,000 rpm 離心 2 分鐘；棄去上清，沉淀中直接
加入 100 μL DNA 提取液充分混勻，沸水浴 10 分鐘（誤差不超過 1 分鐘）。
13,000 rpm 離心 5 分鐘，取上清 4 μL 做 PCR 反應(yīng)。
4. 超純水作為陰性對(duì)照。如進(jìn)行定量檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照品（1×107
copies/mL）需
要進(jìn)行 10、100、1000 倍梯度稀釋。
二、試劑配制
取 n×35 μL 熒光 PCR Mix 與 n×1 μL 內(nèi)部對(duì)照品，以及 n×0.4 μL 酶
（Taq+UNG）（n 為反應(yīng)管數(shù)），振蕩混勻數(shù)秒，3000 rpm 離心數(shù)秒。（備注：
如不使用內(nèi)部對(duì)照品，可用 n×1 μL 的超純水代替補(bǔ)足。）
三、加樣
取上述混合液 36 μL 置于薄壁 PCR 反應(yīng)管或 PCR 反應(yīng)板中，然后將已處
理標(biāo)本、陽(yáng)性對(duì)照品、超純水各 4 μL 分別加入薄壁 PCR 反應(yīng)管或 PCR 反應(yīng)板
中，蓋好薄壁 PCR 反應(yīng)管蓋或 PCR 反應(yīng)板膜，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
四、PCR 擴(kuò)增
反應(yīng)管置于定量熒光 PCR 儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置如下：
過程 溫度 時(shí)間
37℃ 2 分鐘
預(yù)變性 94℃ 2 分鐘
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
93℃ 15 s
60℃ 60 s
 單點(diǎn)熒光檢測(cè)在 60℃。反應(yīng)體系 40μL。
熒光通道檢測(cè)選擇：選用 FAM 和 HEX （或 VIC/JOE）通道。
備注：如使用 ABI 系列 PCR 儀，請(qǐng)務(wù)必于 passive reference 和 quencher
處均選擇“none”。
五、基線和閾值設(shè)定
基線調(diào)整取 6-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過超純
水檢測(cè)熒光曲線的zui高點(diǎn)。
n×35 μL 混合液 + n×1 μL 內(nèi)對(duì)照+ n×0.4 μL 酶
n×36 μL分裝 加 4 μL 模板
上機(jī)
+
六、校準(zhǔn)程序
進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)需要進(jìn)行校準(zhǔn)程序，陽(yáng)性對(duì)照品處理和加樣在使用方法的一
和二中已經(jīng)說明；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將陽(yáng)性對(duì)照品濃度輸入儀器軟件中，儀器自動(dòng)生成
標(biāo)準(zhǔn)曲線。
七、實(shí)際結(jié)果的判斷
通道 Ct 值 結(jié)果判斷
FAM UNDET 或 40 樣本低于檢測(cè)限，報(bào)告為陰性
FAM ≤38 報(bào)告為陽(yáng)性
FAM 38~40 復(fù)檢一次，如仍為 38~40，則報(bào)告為陰性
進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)，儀器生成標(biāo)準(zhǔn)曲線后，自動(dòng)顯示待測(cè)樣品定量值。
關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 豬、牛、羊布魯氏菌病 PCR 檢測(cè)試劑盒（CAT#:11-130）
 20151117xh

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