產(chǎn)品屬于：

商品介紹：

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1．采用*的Formazan溶解液，可以充分溶解formazan，減少誤差。

2．背景低，靈敏度高，線性范圍寬，重復(fù)性好。

3．本產(chǎn)品為足夠500次(5個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板)微孔板檢測(cè)。

4．可用于生物活性因子活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性測(cè)定等。

使用方法：

下面操作是檢測(cè)細(xì)胞毒性的試驗(yàn)，其他應(yīng)用跟此類似或更簡(jiǎn)單(如生長(zhǎng)曲線試驗(yàn))，操作步驟可以以此為基礎(chǔ)稍作修改即可，故不再贅述。

㈠、接種細(xì)胞

1．按常規(guī)胰酶消化法消化匯合的單層細(xì)胞，收集到含血清的培養(yǎng)基中。

2．200g離心5分鐘收集細(xì)胞沉淀。

3．用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸浮液并計(jì)數(shù)。

4．將細(xì)胞稀釋到2.5×103個(gè)/mL～5×10個(gè)/mL之間(需要根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度決定)，如果不知道生長(zhǎng)數(shù)度，一般可以稀釋到1×10個(gè)/mL。

5．將足夠量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中(便于用排槍取樣)。一個(gè)96孔板的MTT檢測(cè)需要約20mL的細(xì)胞懸液。

6．用排槍在96孔板除的第2-11列各孔正中央加入200μL細(xì)胞懸液(對(duì)正常細(xì)胞)。如果是腫瘤細(xì)胞，則加入100μL腫瘤細(xì)胞懸液和100μL培養(yǎng)基(總體積為200μL)。注意：一定要把細(xì)胞加在孔的正中，否則細(xì)胞會(huì)聚集在孔的角落處，影響試驗(yàn)。

7．用排槍在96孔板除的第1和第12各孔中加入跟細(xì)胞懸液等體積的培養(yǎng)基。第1 列各孔將作為+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對(duì)照(用于測(cè)OD時(shí)調(diào)零)，第12列加培養(yǎng)基的作用是減少邊緣效應(yīng)對(duì)第11 列反應(yīng)的影響。

8．按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法在37℃和5% CO2條件下孵育1-3天，使細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期。

㈡、藥物處理

9．用培養(yǎng)基將藥物稀釋到8個(gè)待測(cè)濃度(如果不知道待測(cè)濃度，則需要預(yù)試驗(yàn)確定)，一般一種藥物需要做3塊平行板。

10．去除第2到第11列(共10列)各孔中的培養(yǎng)基(不要觸動(dòng)細(xì)胞)，保留第1 列和第12列各孔中的培養(yǎng)基。

11．在第2和第11列(共2列)的各孔中加入200μL新鮮培養(yǎng)基，這些孔將作為+培養(yǎng)基+細(xì)胞-藥物的對(duì)照。

12．在第3到第10列(共8列)各孔中加入8個(gè)濃度梯度的待測(cè)藥物，每列加入一個(gè)濃度的藥物。

13．按常規(guī)方法把96孔板繼續(xù)放在在37℃和5% CO2條件下孵育一定的時(shí)間，此段時(shí)間即為藥物處理細(xì)胞的時(shí)間，由用戶自己決定。

14．處理結(jié)束后去除第2 到第11列(共10列，均含細(xì)胞)所有孔中的培養(yǎng)基，并再加入100μL新鮮培養(yǎng)基。

15．每天換培養(yǎng)使細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增2-3倍(所需時(shí)間隨細(xì)胞不同而不同)。

㈢、存活細(xì)胞計(jì)數(shù)

16．在生長(zhǎng)末期，去除第1到第11列各孔中的培養(yǎng)基后，再加入100μL新鮮培養(yǎng)基和10μL溶液A(含MTT成分)，用錫箔包裹住96孔板后放在37℃和5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-8小時(shí)。注意：溶液A在低溫情況下會(huì)凝固，使用前請(qǐng)室溫放置或20-25℃水浴至全部溶解，搖勻后使用。MTT有致癌性，一定要帶手套操作。

17．小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基(含溶液A)。由于培養(yǎng)基可能會(huì)影響光吸收，最好盡可能去除。

18．每孔加入100μL溶液B，置搖床上低速振蕩10分鐘，使MTT形成的formazan結(jié)晶物充分溶解。

19．由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，故需要立即在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇490nm測(cè)定吸光度。

?注意：用第1 列各孔(+培養(yǎng)基-細(xì)胞+MTT對(duì)照)調(diào)零。

20．計(jì)數(shù)同樣處理的各次重復(fù)的平均值。

21．以藥物濃度為橫軸，以吸光度為縱軸繪制曲線。由于各處理吸光度絕對(duì)值差別很大，一般需將其轉(zhuǎn)化成生長(zhǎng)抑制率(以不加藥物的第2和第11列各孔數(shù)據(jù)的平均數(shù)作為100%)，這樣便于計(jì)算出IC50，用于各種藥物處理效果的比較。注意：如果測(cè)生長(zhǎng)曲線，則以時(shí)間為橫軸。正常生長(zhǎng)曲線一般呈現(xiàn)S型，具有促進(jìn)作用的則斜率加大。

培養(yǎng)操作步驟：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布；

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）；

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)；

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中；

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。

phospho-ATG16A(Ser213)磷酸化自噬相關(guān)蛋白16A抗體

phospho-AKT3 (Ser472)磷酸化蛋白激酶AKT3抗體

phospho-ADRB2 (Ser261)磷酸化腎上腺素能受體β2抗體

phospho-AQP2(Ser261)磷酸化水通道蛋白2抗體

phospho-ATG3 (Tyr18)磷酸化自噬相關(guān)蛋白3抗體

ALDOB醛縮酶2抗體

AMY2A胰腺α淀粉酶抗體

ANKRD11錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白11抗體

phospho-c-ABL1+2 (Tyr393+429)磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

phospho-ATF2 (Thr53)磷酸化活化復(fù)制因子2抗體

AKR1D1醛固酮還原酶家族1成員D1抗體

ARP4肝血管生成素相關(guān)蛋白抗體

ABHD5自水解酶結(jié)構(gòu)域5蛋白抗體

ACOT8酰基硫酯酶8

Agpat2溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶β抗體

AFP4bAFP4b蛋白抗體

APOC2載脂蛋白C2抗體

Apolipoprotein A V載脂蛋白A5抗體

APOA2載脂蛋白A2抗體

AGPAT4溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶D抗體

HAVSMC, 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞 Human

LX-2, 人肝星形細(xì)胞株 Human

3T3-L1, 小鼠前脂肪細(xì)胞 Mouse

C2C12, 小鼠肌原細(xì)胞 Mouse

細(xì)胞名稱 種屬

MCF-7（MCF7）（ATCC來(lái)源）, 人乳腺癌細(xì)胞 Human

MDA-MB-231（ATCC來(lái)源）, 人乳腺癌細(xì)胞 Human

Raji，人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞 Human

Saos-2，人成骨肉瘤細(xì)胞 Human

Caco-2，人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞 Human

NCI-N87 [N87]人胃癌細(xì)胞 Human

MGC80-3（MGC-803）人胃癌細(xì)胞 Human

EC109，人食管癌細(xì)胞 Human

HGC-27人胃癌細(xì)胞 Human

AGS人胃腺癌細(xì)胞 Human

U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 Human

THP-1人單核白血病細(xì)胞 Human

HuH-7人肝癌細(xì)胞 Human

SK-MEL-1, 人皮膚黑色素瘤細(xì)胞 Human

A549, 人肺癌細(xì)胞系 Human

SKOV3/Taxol-25, 人卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株 Human

A-375 [A375], 人惡性黑素瘤細(xì)胞株 Human

A549/DDP, 人肺腺癌耐藥細(xì)胞株 Human

SP2/0, 小鼠骨髓瘤細(xì)胞 Mouse

MTT檢測(cè)試劑盒WM35, 人黑色素瘤細(xì)胞 Human

BxPC-3, 人原位胰腺腺癌細(xì)胞株 Human

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；

二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。