穩(wěn)定細(xì)胞株篩選 流式

摘要：本實(shí)驗(yàn)使用過表達(dá)human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa細(xì)胞。該病毒的表達(dá)框?yàn)閜Lenti-CMVOct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV啟動子驅(qū)動Oct-4-EGFP基因的表達(dá)， 同時由PGK啟動子驅(qū)動 puromycin抗性基因的表達(dá)。在感染HeLa細(xì)胞72h后，通過加入并維持2μg/μL的puromycin殺死未被有效感染的細(xì)胞。從而在puromycin藥物的維持下最終獲得Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達(dá)的混合穩(wěn)定株。

關(guān)鍵詞：Oct-4-EGFP，穩(wěn)定細(xì)胞株， HeLa，慢病毒

一、 實(shí)驗(yàn)原理

外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)可分為兩大類，一類是瞬時表達(dá)，一類是穩(wěn)定表達(dá)（永jiu表達(dá)）。前者外源 DNA/RNA不整合到宿主染色體中，雖然可以達(dá)到高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，使宿主細(xì)胞可長期表達(dá)目的基因。建立穩(wěn)定細(xì)胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選。常用的抗性標(biāo)記基因有潮霉素（hygromycin）、新霉su（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B、G418和puromycin進(jìn)行選擇性篩選。 傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉(zhuǎn)染后對靶細(xì)胞進(jìn)行篩選， 最終獲得從單一細(xì)胞擴(kuò)增起來的穩(wěn)定細(xì)胞株， 該方法陽性率低，周期長，工作量大。慢病毒是一種RNA病毒，攜帶的外源基因在病毒感染細(xì)胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組以后才能表達(dá)。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端，可以在短時間內(nèi)獲得高效率的穩(wěn)定細(xì)胞株。篩選得到的細(xì)胞或者可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，用于蛋白的擴(kuò)增和富集；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細(xì)胞株。

二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

通過慢病毒感染配合藥物篩選的方法獲得穩(wěn)定表達(dá)Oct-4-EGFP的HeLa穩(wěn)定細(xì)胞株。

三、 實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)共分以下3個主要步驟：

1. 細(xì)胞鋪板 將HeLa細(xì)胞按30%的融合度接種到24孔板：

1) HeLa細(xì)胞配成1×105 cells/mL細(xì)胞懸液，待鋪板。

2) 每孔鋪500μL，即5×104 cells/well，鋪1塊24孔板。

2. 感染慢病毒 12~20h后感染慢病毒：

1) 根據(jù)公式計(jì)算病毒用量： （細(xì)胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）。

2) 本實(shí)驗(yàn)中MOI取10，吸去與加入病毒體積相同培養(yǎng)基。

3) 每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL)，使polybrene終濃度達(dá)到5μg/mL。

4) 24h后換，棄去培養(yǎng)基后每孔加入500μL新鮮的培養(yǎng)基。

3. 穩(wěn)定株篩選

1) 72h以后，加入終濃度2μg/μL puromycin。每隔2-3天換一次終濃度2μg/μL puromycin新鮮培養(yǎng)基。

2) 藥物篩選約10天后，拍熒光照片。

3) 穩(wěn)定細(xì)胞株凍存。

四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1. 慢病毒感染HeLa細(xì)胞72h后熒光照片，MOI為10

圖2. 慢病毒感染HeLa細(xì)胞，篩選10天后穩(wěn)定株熒光照片

結(jié)論：從圖1可以看到，在MOI為10條件下，HeLa的感染效率約為80%。根據(jù)圖2，使用puromycin藥物篩選10天后，表達(dá)目的基因的HeLa的比例在90%以上，且熒光亮度增強(qiáng)。Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞株篩選成功。

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