產(chǎn)品簡介：

澳洲立克次體（Rickettsiaaustralis）是一種屬于立克次體科的原核生物。其基因組長度大約為 1.3 百萬堿基對，并且是單鏈雙向的，具有線狀結(jié)構(gòu)。這種立克次體通過硬蜱作為媒介傳播給人類和其他脊椎動物宿主。它可以引起昆士蘭蜱傳斑疹傷寒，這是一種在澳大利亞東部沿海地區(qū)常見的疾病。感染通常開始于蜱蟲叮咬處形成一個丘疹， 隨后可能發(fā)展成為壞死性黑色焦痂。未經(jīng)治療的病例可能會出現(xiàn)持續(xù)發(fā)熱、頭痛、乏力、   肺炎、腦炎，甚至死亡，對人體健康造成較大威脅。因此，快速檢測澳洲立克次體具有重要意義。為此，本公司以探針法 qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了澳洲立克次體的檢測試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)澳洲立克次體 DNA 高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法 qPCR 反應(yīng)。

7.澳洲立克次體探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實(shí)時熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

2×Probe qPCR MasterMix、熒光 PCR 專用模板稀釋液、超純水、澳洲立克次體 qPCR 引物-探針干粉、澳洲立克次體陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 DNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），

一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10 μL 上步所得第 4 號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA -提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢

后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分樣品管

N+2 個PCR

陰性對照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

2×Probe qPCR MasterMix各 10 μL10 μL各 10 μL

澳洲立克次體

qPCR 引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個待測 DNA 樣本各 7 μL不加不加

超純水不加7 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（1-6 號）

不加

不加各 7 μL（2 號樣到

2 號管，3 號樣到 3 號管…）

11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 qPCR：

過程溫度時間

預(yù)變性95℃10 min.

PCR 反應(yīng)

（45 個循環(huán)）95℃15 sec.

60℃30 sec（采集 FAM 通道的熒光

信號，淬滅基團(tuán)為 TAMRA）

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽性對照或 PCR 陽性對照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或 PCR 陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實(shí)驗(yàn)無效， 不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

13.如果陰性對照和陽性對照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值， 再推算出其濃度。

15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須沒有讀數(shù)， 或者大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40。對待測樣品，如果其 Ct 沒有讀數(shù)、大于或等于 40 則均為陰性，如果小于 40 則為陽性。

選擇我們的澳洲立克次體探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！