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藥典液相色譜方法的調(diào)整
根據(jù)藥典附錄“液相色譜法”規(guī)定，可調(diào)整適當(dāng)參數(shù)
---調(diào)整目的：滿足系統(tǒng)適用性的要求
---系統(tǒng)適用性的要求
---HPLC方法調(diào)整的考慮因素
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
1、理論塔板數(shù)：
----反映整個(gè)色譜系統(tǒng)的狀態(tài)
填料狀態(tài)
管線連接
----有不同的計(jì)算方法
主要是峰寬取值方法不同
不同計(jì)算方法計(jì)算結(jié)果有差異
----影響因素：
被測(cè)組分的保留時(shí)間、進(jìn)樣量等
積分參數(shù)
系統(tǒng)死體積
測(cè)定色譜方法、樣品與計(jì)算方法保持恒定，以便比較
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
2、分離度：
---影響因素：
* 影響柱效的因素
色譜柱尺寸
填料性能
進(jìn)樣量
* 影響分離選擇性的因素
流動(dòng)相組成
色譜柱品牌
柱溫
* 柱外體積
---有不同的計(jì)算方法，結(jié)果有差異
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
3、重復(fù)性（進(jìn)樣精密度）：
* 外標(biāo)法：對(duì)照品溶液（n：5）
峰面積RSD：2.0%
* 內(nèi)標(biāo)法：相當(dāng)于80%，100%，120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量?jī)?nèi)標(biāo)
溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子（n：6）
校正因子RSD：2.0%
* 手動(dòng)進(jìn)樣器：定量環(huán)（滿環(huán)進(jìn)樣：進(jìn)樣體積至少為3倍定量環(huán)體積）
自動(dòng)進(jìn)樣器：準(zhǔn)確定量范圍
05版藥典的系統(tǒng)適用性要求
4、拖尾因子：
----影響因素：
* 與理論塔板數(shù)相關(guān)的因素：
色譜柱選擇、流動(dòng)相、進(jìn)樣量、積分參數(shù)等
* 與檢測(cè)品種與方法相關(guān)
* 峰高法定量分析：0.95~1.05
HPLC方法參數(shù)調(diào)整
用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，應(yīng)符合要求。
如達(dá)不到要求，可對(duì)色譜分離條件做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
不得改變：固定相種類，流動(dòng)相組成，檢測(cè)器種類。
可改變：色譜柱尺寸，牌號(hào)，填料粒度，流動(dòng)相流速，流動(dòng)相各組成的比例，梯度洗脫時(shí)間長(zhǎng)度，柱溫，進(jìn)樣量，檢測(cè)器靈敏度等
常見的液相色譜參數(shù)的調(diào)整：其他參數(shù)
柱溫：升高柱溫有利于改變峰形和分離度，但要注意柱的zui高耐受力
進(jìn)樣量：在滿足檢測(cè)要求的前提下，盡量減少進(jìn)樣量
供試品溶劑：溶劑強(qiáng)度應(yīng)等同或低于流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度
反相色譜中溶解樣品的溶劑：
* 甲醇并不是良溶劑
* 推薦溶劑
是流動(dòng)相
梯度為起始流動(dòng)相
盡可能有水溶液參與
如果不得不用有機(jī)溶劑溶解，盡可能使用小進(jìn)樣量或兩步稀釋
常見的液相色譜參數(shù)的調(diào)整：流動(dòng)相
改變?nèi)軇┍壤焊鶕?jù)色譜柱類型與狀態(tài)
添加劑
掃尾劑：有機(jī)胺
緩沖溶液：10-50mM；從20mM開始，越少越好
離子對(duì)試劑：平衡時(shí)間長(zhǎng)，易在色譜柱中保留
緩沖液pH
酸含量
緩沖液的緩沖容量：pKa+-1
對(duì)方法耐用性的影響
常見的液相色譜參數(shù)的調(diào)整：固定相
關(guān)注不同品牌色譜柱的選擇性差異
堿性化合物：封端柱、內(nèi)嵌極性基團(tuán)柱
pH耐受范圍
耐受高水相柱：阿莫西林含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定
關(guān)注色譜柱規(guī)格對(duì)分離的影響
長(zhǎng)度：
內(nèi)徑：可決定流速
粒度：越小，柱效越高
孔徑：與樣品分子量大小相關(guān)
藥品雜質(zhì)分析：雜質(zhì)定義
任何影響藥品純度的物質(zhì)
在藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)系指在按照經(jīng)國(guó)家有關(guān)藥品監(jiān)督管理部門依法審查批準(zhǔn)的規(guī)定工藝和規(guī)定的原輔料生產(chǎn)的藥品中，由其生產(chǎn)工藝和原輔料帶入的雜質(zhì)，或經(jīng)穩(wěn)定性試驗(yàn)確證的在貯存過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。
藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)不包括：
* 變更生產(chǎn)工藝或原輔料而產(chǎn)生的新的雜質(zhì)：重新申報(bào)
* 摻入或污染的外來物：假劣藥品，非法定方法予以檢測(cè)
液相色譜法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查
儀器要求：
檢測(cè)靈敏度
檢測(cè)手段-專屬性
數(shù)據(jù)處理：積分參數(shù)（zui小峰高和zui小峰面積設(shè)定）
已知雜質(zhì)：采用對(duì)照品或相對(duì)保留時(shí)間定位
專屬性：采用DAD確定UV紫外光譜或不同波長(zhǎng)的響應(yīng)情況
定量：已知雜質(zhì)雜質(zhì)：測(cè)定對(duì)主成分的相對(duì)響應(yīng)因子
未知雜質(zhì)：主成分自身對(duì)照法
雜質(zhì)確定
可用DAD、MSD確定雜質(zhì)峰的數(shù)目
用空白試驗(yàn)排除干擾
* 空白溶劑進(jìn)樣（考慮進(jìn)樣溶劑的影響）
* 運(yùn)行空白梯度（考慮流動(dòng)相溶劑質(zhì)量的影響）
降低系統(tǒng)殘留的影響
* 手動(dòng)進(jìn)樣閥的清洗
* 自動(dòng)進(jìn)樣器應(yīng)采用洗針進(jìn)樣模式
考慮色譜分離方法的影響
* 分離度、進(jìn)樣量
影響檢測(cè)器靈敏度的因素
檢測(cè)器
* 流通池：體積大，靈敏度高
* 紫外燈能量
* 采樣頻率：大于15Hz時(shí)可準(zhǔn)確描述峰
死體積
* 儀器連接管線應(yīng)盡量減小柱外體積，避免色譜峰的擴(kuò)散
* 運(yùn)行空白梯度（考慮流動(dòng)相溶劑質(zhì)量的影響）
上樣量
流動(dòng)相：在低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)，影響大