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北京西美杰科技有限公司
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蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）常見問題解析
2021-4-23 閱讀(1247)
蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot，WB）是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達情況的信息。
WB實驗中經(jīng)常會出現(xiàn)各種問題，得到不滿意的結(jié)果。西美杰代理的SeraCare（KPL）品牌做為免疫學(xué)產(chǎn)品供應(yīng)商擁有近40年的產(chǎn)品研發(fā)經(jīng)驗，對WB實驗有一定深入的了解，今天就為廣大客戶分享和總結(jié)WB中常見問題和解決辦法。
問題 | 可能原因 | 解決辦法 |
轉(zhuǎn)膜不充分導(dǎo)致信號較弱 | 膜沒有*均勻濕透 | 使用100%甲醇浸透膜 |
靶蛋白分子量小于10000 | 選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間 | |
靶蛋白等電點等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液PH值 | 嘗試使用其他緩沖液 | |
甲醇濃度過高 | 降低甲醇濃度或者使用乙醇/異丙醇替代 | |
轉(zhuǎn)移時間不夠 | 對于厚的膠以及高分子量蛋白質(zhì)需要延長轉(zhuǎn)移時間 | |
洗膜不充分 | 增加洗液體積和洗滌次數(shù) | |
阻斷不充分 | 增加封閉液孵育時間，或者提高溫度。 | |
二抗?jié)舛?/span>過高 | 降低二抗?jié)舛?/span> | |
檢測過程中膜干燥 | 保證充分的反應(yīng)液 | |
曝光過度 | 縮短曝光時間 | |
抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng) | 檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng) | |
沒有陽性條帶或條帶信號較弱 | 抗體染色不充分 | 增加抗體濃度，延長孵育時間 |
酶活降低甚至失活 | 直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)，有活性的酶聯(lián)物 | |
標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 | 設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因 | |
試劑不匹配 | 一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗證二級檢測系統(tǒng)的有效性 | |
一抗失效 | 選擇在有效期內(nèi)抗體，并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液 | |
洗膜過度 | 縮短洗滌時間 | |
HRP抑制劑 | 所用溶液和容器中避免含有 疊dan化\ 鈉 | |
抗體活性降低 | 選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時間放置 | |
蛋白轉(zhuǎn)移不充分 | 見上述 | |
封閉過度 | 減少封閉劑的量或縮短時間，換用不同封閉劑類型 | |
曝光時間過短 | 延長曝光時間 | |
條帶位置（大?。┎粚Γ蛴蟹翘禺愋詶l帶 | 二抗的非特異性結(jié)合 | 增加一個對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強的，只針對重鏈的） |
一抗的特異性不夠 | 使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性 | |
蛋白降解 | 使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑，實驗中增加內(nèi)參 | |
蛋白二聚體或多聚體存在 | 增加蛋白質(zhì)變性過程及強度 | |
抗體濃度過高 | 降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶 | |
蛋白上樣量過大 | 降低樣本上樣量 | |
背景斑駁 | 封閉劑中有聚集體 | 使用前過濾封閉劑 |
HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體 | 過濾二抗試劑，去除聚集體 | |
膜上出現(xiàn)反像 | HRP含量過高 | 降低酶聯(lián)二抗的濃度 |
西美杰代理的SeraCare（KPL）品牌是專業(yè)親和純化二抗和底物顯色系統(tǒng)生成商，能為廣大診斷企業(yè)、科研用戶提供600多種二抗，覆蓋20多個物種，18種標(biāo)記，具有高純度、特異性強、批間穩(wěn)定等特點，產(chǎn)品經(jīng)過ISO90001質(zhì)量體系認(rèn)證。
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