在PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們經(jīng)常會(huì)遇到各種奇特的擴(kuò)增曲線，如何正確解讀這些曲線并且做出恰當(dāng)?shù)慕鉀Q方案是我們一線實(shí)驗(yàn)者需要練就的基本功。今兒，將多年累積的功力編成“武功秘籍”奉上，助你PK掉那些令人犯暈的異常曲線。

異常曲線1：PCR擴(kuò)增抑制

原因分析：H07存在擴(kuò)增抑制

解決方案：將樣本稀釋后進(jìn)行擴(kuò)增（抑制物的影響可通過(guò)稀釋樣本消除

異常曲線2：自動(dòng)基線設(shè)置問(wèn)題

原因分析：自動(dòng)基線問(wèn)題

解決方案：手動(dòng)設(shè)置基線。將Baseline End設(shè)置為“擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)的前一個(gè)循環(huán)”即，圖片展原始為26，將其設(shè)置為20，點(diǎn)擊OK即可恢復(fù)正常曲線。

異常曲線3：熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中無(wú)Ct值出現(xiàn)

原因分析：

（1）PCR參數(shù)設(shè)置錯(cuò)誤：在設(shè)計(jì)循環(huán)參數(shù)時(shí)沒(méi)有設(shè)置熒光信號(hào)采集；

（2）模板降解: 避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況；

（3）引物或者探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性；

（4）電腦設(shè)置了自動(dòng)休眠。

解決方案：按照原因分析進(jìn)行一一核查，對(duì)癥處理。

異常曲線4：斜直線型擴(kuò)增曲線

PCR實(shí)驗(yàn)*檢測(cè)呈斜直線型擴(kuò)增曲線，再次復(fù)檢后結(jié)果基本均為正常陰性。

原因分析：

分液不準(zhǔn)確，檢查檢測(cè)后的反應(yīng)管可發(fā)現(xiàn)管內(nèi)的PCR反應(yīng)液量明顯少于正常管；反應(yīng)管氣密性差，反應(yīng)過(guò)程中溶液蒸發(fā)引起探針濃度增加，導(dǎo)致曲線呈斜直線狀。

解決方案：分液均勻，上機(jī)前檢查八連管液面是否在同一水平線上；八連管蓋蓋嚴(yán)，上機(jī)前檢查是否有縫隙。

異常曲線5：擴(kuò)增曲線末尾起跳

PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果中有曲線出現(xiàn)末尾起跳但是沒(méi)有完整擴(kuò)增的現(xiàn)象。

原因分析：

（1）陰參曲線末尾起跳，通常表示存在污染；

（2）復(fù)檢樣本，排除非特異性擴(kuò)增的可能性；

（3）正常樣本也可存在曲線末尾起跳，表示樣本濃度低或者加樣量不準(zhǔn)確。

解決方案：排除是否存在污染；排除污染原因后復(fù)檢樣本，如果復(fù)檢后曲線為陰性直線則說(shuō)明之前的末尾起跳為非特異性擴(kuò)增，如果復(fù)檢后曲線仍與之前一致則說(shuō)明末尾起跳表示該樣本中待檢病毒核酸的濃度偏低。

異常曲線6：山域型曲線

原因分析：嚴(yán)重的蒸發(fā)會(huì)呈現(xiàn)先上升后下降的曲線，輕微的蒸發(fā)會(huì)是一種緩慢的上升，這兩類異常的曲線可以看一下檢測(cè)后的反應(yīng)管液面是否有下降的現(xiàn)象來(lái)證明。

解決方案：上機(jī)檢測(cè)前檢查八連管管蓋，保證無(wú)縫隙后上機(jī)擴(kuò)增。

異常曲線7：擴(kuò)增曲線有向上或者向下的尖峰

原因分析：

（1）儀器不穩(wěn)定導(dǎo)致的擴(kuò)增曲線異常（也可能突然停電或者電壓不穩(wěn)）；

（2）如果尖峰向下，可能是鹵素?zé)衾匣掳l(fā)射光源不穩(wěn)定（指鹵鎢燈光源的激發(fā)器）

（3）如果是單一的孔位出現(xiàn)尖峰，除了考慮儀器或者孔位問(wèn)題外，還要考慮反應(yīng)體系是否有氣泡所致。

解決方案：按照原因分析進(jìn)行一一核查，對(duì)癥處理。

背景知識(shí)

判斷擴(kuò)增曲線是否良好的指標(biāo)

1.曲線拐點(diǎn)清楚，特別是低濃度樣本指數(shù)期明顯，擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線平而無(wú)上揚(yáng)現(xiàn)象，低濃度樣本擴(kuò)增曲線指數(shù)期明顯。

2.曲線指數(shù)期斜率與擴(kuò)增效率成正比，斜率越大擴(kuò)增效率越高。

3.標(biāo)準(zhǔn)的基線平直或略微下降，無(wú)明顯的上揚(yáng)趨勢(shì)。

4.各管的擴(kuò)增曲線平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近。