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            上海聯(lián)碩生物科技有限公司
                                                                        
            
										  中級(jí)會(huì)員 | 第17年									
            
                                    								
            

							
            
						
            
                        

					
            
										
            
						
            
                            							
            
								
            
								
            
									
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            HRP標(biāo)記抗體之簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法
            
						
            
							時(shí)間：2011/12/23閱讀：2096
							
            
							
				
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                                                       HRP標(biāo)記抗體之簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法
            2. 試劑及器材
            （1）0.1M NaIO4：稱(chēng)取241mg高碘酸鈉（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)830602）溶于蒸餾水10ml中。
            （2）1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液：0.2M NaAc （1.361克/50ml）  3.7ml；0.2M HAc （0.601ml/50ml）  6.3ml；加蒸餾水至2,000ml。
            （3）0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液：Na2CO3 0.32g；NaHCO3 0.586g；加蒸餾水至50ml，再用蒸餾水作20倍稀釋?zhuān)闯?.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
            （4）NaBH4溶液（4mg/ml）：臨用時(shí)稱(chēng)取NaBH4 4mg溶于1ml蒸餾水中。
            （5）其它的試劑及器材可參見(jiàn)戊二醛標(biāo)記法。
            3. 標(biāo)記步驟
            （1）稱(chēng)取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
            （2）于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
            （3）將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)夜。
            （4）加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0-9.5，然后立即加入10mg IgG（抗體，或SPA 5mg）在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。
            （5）加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃ 2小時(shí)。
            （6）將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過(guò)夜。
            （7）在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃ 1小時(shí)。
            （8）3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
            （9）將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PBS緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測(cè)），10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
            4. 結(jié)果判定
            除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
            IgG量（mg/ml）＝（OD280nm-OD403nm×0.3）×0.62
            
							
							
							
						
            
					
            
				
            
			
            
		
            
		
		
		
		 



  
    
    				
			

		
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

    

     
     
     
	 




	 
	
	
	

            
	
            
		
            
			
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