關(guān)于蛋白質(zhì)綴合的簡捷方案你了解多少？

以下是使用SMCC和DTT詳細(xì)說明PE-蛋白質(zhì)綴合的方案，供參考。

注意：該方案使用IgG（MW：150kDa）作為其綴合蛋白，但是其他蛋白質(zhì)可以用適當(dāng)修飾的量替代。

PE準(zhǔn)備

注意：如果PE作為溶液（通常為硫酸銨）儲(chǔ)存，則必須首先進(jìn)行離心分離。離心并棄去上清液，然后在PBS中以與原溶液相同的濃度重建沉淀物。

如果PE以固體形式儲(chǔ)存，立即懸浮在PBS中。

對(duì)于計(jì)劃結(jié)合的每mg IgG，使用3.5 mg PE。

1.將PE溶液透析，每1升PE對(duì)1升PBS進(jìn)行透析。重復(fù)一次。

2.對(duì)每升PE的1升透析緩沖液*透析PE溶液。

3.通過測量280,565和620 nm處的吸光度來確保PE溶液的純度。得到的565 / 620nm讀數(shù)大于50的比率是藻藍(lán)蛋白去除的指標(biāo)，并且565/280比率大于5表明溶液的進(jìn)一步純度。

PE衍生化（SMCC-PE）

1.在其用于以下步驟和綴合之前，立即在DMSO中制備10mg / mL SMCC原液。

2.每mg PE將11μlSMCC溶液加入到步驟1b產(chǎn)生的PE溶液中。將溶液包裹在鋁中，孵育1小時(shí)，旋轉(zhuǎn)。

3.用交換緩沖液*平衡凝膠過濾柱，并將前一步驟中的衍生化PE通過其上。

減少IgG

1.在蒸餾水中制備1M DTT（15.4 mg /100μl）溶液。

2.在4mg / mL或更高的適當(dāng)緩沖液中制備IgG。

3.通過在混合的同時(shí)每mL IgG溶液添加20μlDTT原液來產(chǎn)生20mM IgG溶液。在沒有額外混合的情況下，站立30。

4.用交換緩沖液平衡過濾柱，并將還原的IgG通過。從柱中收集0.25mL餾分并以大多數(shù)池合并。

一旦完成該步驟，就完成以下結(jié)合，并且完成步驟2（同時(shí)）。

共軛

1.每mg還原的IgG溶液加入3.2mg SMCC-PE。用鋁包裹并在室溫下旋轉(zhuǎn)1小時(shí)。

2.準(zhǔn)備10 mg NEM在1 mL DMSO中的溶液。

3.每mg IgG向IgG溶液中加入34μg。再次包裹鋁并在室溫下旋轉(zhuǎn)20分鐘。

4.可以將終溶液透析或在柱上運(yùn)行到合適的緩沖液中。

注意：不要凍結(jié)結(jié)合物。