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                         人白三烯人白三烯E4（LTE4）酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                         人人白三烯白三烯            酶聯(lián)免疫分析酶聯(lián)免疫分析

                                 試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

                                 試劑盒使用說明書試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

本試劑盒僅供研究使用本試劑盒僅供研究使用

產(chǎn)品編號產(chǎn)品編號：：CSB-E05176h

產(chǎn)品編號產(chǎn)品編號：：

檢測范圍檢測范圍：：12.5 ng/ml - 800 ng/ml

檢測范圍檢測范圍：：

zui低檢測限zui低檢測限：：3 ng/ml

zui低檢測限zui低檢測限：：

特異性特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的：               人LTE4，且與其他相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

特異性特異性：：

有效期有效期：：6 個月

有效期有效期：：

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：ELISA 法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中LTE4 含量。

預(yù)期應(yīng)用預(yù)期應(yīng)用：：

說明說明

說明說明

    1．試劑盒保存：-20℃（較長時間不用時）；2-8℃（頻繁使用時）。

    2．濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。

    3．中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準(zhǔn)。

    4．剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造

       成任何影響。

實驗原理實驗原理

實驗原理實驗原理

    用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗LTE4 抗體的微孔中依次加入標(biāo)本

或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗LTE4 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB 顯

色。TMB  在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的

深淺和樣品中的LTE4 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度 （OD 值），計算樣

品濃度。

試劑盒試劑盒組成及試劑配制組成及試劑配制

試劑盒試劑盒組成及試劑配制組成及試劑配制

1.  酶聯(lián)板酶聯(lián)板（Assay plate ）：一塊（96 孔）。

    酶聯(lián)板酶聯(lián)板

2.  標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 （Standard）：2 瓶（凍干品）。

    標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品

3.  樣品稀釋液樣品稀釋液（Sample Diluent）：1×20ml/瓶。

    樣品稀釋液樣品稀釋液

4.  生物素標(biāo)記抗體稀釋液生物素標(biāo)記抗體稀釋液（（Biotin-antibody Diluent）：）1×10ml/瓶。

    生物素標(biāo)記抗體稀釋液生物素標(biāo)記抗體稀釋液（（                     ））

5.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （（HRP-avidin Diluent）：）1×10ml/瓶。

    辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 （（                 ））

6.  生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體（（Biotin-antibody）：）1×120μl/瓶（1：100）

    生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體（（              ））

7.  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 （（HRP-avidin）：）1×120μl/瓶（1：100）

    辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素 （（          ））

8.  底物溶液底物溶液 （（TMB Substrate）：）1×10ml/瓶。

    底物溶液底物溶液 （（             ））

9.  濃洗滌液濃洗滌液 （（Wash Buffer）：）1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。

    濃洗滌液濃洗滌液 （（          ））

10. 終止液終止液（（Stop Solution）：）1×10ml/瓶（2N H  SO4）。

    終止液終止液（（            ））                2

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

需要而未提供的試劑和器材需要而未提供的試劑和器材

1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀

2.  高速離心機

3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱

4.  干凈的試管和Eppendof 管

5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，用多通道移液器

6.  蒸餾水，容量瓶等

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存

標(biāo)本的采集及保存標(biāo)本的采集及保存

1.  血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2 小時或4℃過夜后于1000g 離心20 分鐘，取上清即可

    檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

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2.  血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000 g 離心15

    分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g 離心20  分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放

    于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。。

注注：：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。。

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

標(biāo)本的稀釋原則標(biāo)本的稀釋原則：：

首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)

曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細的記錄。zui后計算濃度

時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10 分鐘以上，

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：：

然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為800 ng/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋800 ng/ml，

400 ng/ml，200 ng/ml，100 ng/ml，50 ng/ml，25 ng/ml，12.5 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)

準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15 分鐘內(nèi)配制。

如配制400 ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml       （不要少于0.5ml）800 ng/ml 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml

樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則的稀釋原則：：

生物素標(biāo)記抗體生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則的稀釋原則：：

臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制

 （每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 生物素標(biāo)記抗體加990μl 生物素標(biāo)

記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則的稀釋原則：：

辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則的稀釋原則：：

臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的

總量配制（每孔100μl），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記親和

素加990μl  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)

配制。

操作步驟操作步驟

操作步驟操作步驟

實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。

每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試

劑盒的檢測范圍。

1.  加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加

    標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸

    及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120 分鐘。

    為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.  棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl                         （取1μl 生物素標(biāo)記

    抗體加99μl 生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），

    37℃,60 分鐘。

3.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2 分鐘，200μl/每孔，甩

    干。

4.  每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液 （同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，

    60 分鐘。

5.  溫育60 分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2 分鐘，200μl/每孔，甩

    干。

6.  依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色 （（30  分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4

                                        （（

    孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔顯色不明顯，即可終止）。

7.  依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量

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    與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入

    終止液。

8.  用酶聯(lián)儀在450nm 波長依序測量各孔的光密度 （OD 值）。 在加終止液后15 分鐘以內(nèi)

    進行檢測。

注：注

注注

1.  用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H  SO4。

                                                                        2

   測量時先用此孔調(diào)OD 值至零。

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過

   氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)

    品、生物素標(biāo)記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。

5.  建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

洗板方法洗板方法

洗板方法洗板方法

手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，

酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘。根據(jù)需

要，重復(fù)此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算計算

計算計算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD 值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪

出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物

的濃度與OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣

品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

注意事項注意事項

注意事項注意事項

1.  當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3. 一次加樣時間控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔。

5.  如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

6.  在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.  底物請避光保存。

8.  不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。