單個(gè)噬菌體在石蠟包埋的組織上進(jìn)行免疫組化

[器材和試劑]

●  裝滿10m1冷的新配制的4％多聚甲醛（PFA）的10m1塑料注射器，并附有1英寸（2．54cm）、25號(hào)針頭（每只鼠一個(gè)）

●  為每只鼠準(zhǔn)備兩只胰島素注射器

●  為每份器官或組織準(zhǔn)備一個(gè)6cm的組織培養(yǎng)皿

●  1．25％（w/v）的阿佛丁水溶液

●  10⁹～lO^lO TU或pfu的噬菌體溶液

●  100％的無(wú)水乙醇

●  石蠟和自動(dòng)組織脫水機(jī)（automated tissue processor）（Tissue-Tek VIP；Miles ScientiFIc）

●  3％（體積分?jǐn)?shù)）過氧化氫（H₂0₂）的PBS溶液

●  1×PBS

●  MilliQ水

●  胰酶（Zymed）

●  fd一抗：兔抗fd的多克隆IgG（Sigma）

●  T7一抗：兔抗T7的多克隆IgG（Ruoslahti Lab）

●  fd和T7的二抗：羊抗兔IgG—HRP（DAKO Corporation）

●．  DAKO抗體稀釋液[含轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（carrier protein）和0．015mol/L NaN₃的Tris—HCl緩沖液]

●  DAB[3^，3^，—二氨基聯(lián)苯胺四氫氯化物（DAKO）]底物溶液。首先將6mg DAB溶于10ml pH為7．5的50mmol/    LTris—HCl溶液。然后將0．1ml的3％H₂0₂溶于其中，如果有任何形式的沉淀就進(jìn)行過濾。溶液必須在配制后的兩小時(shí)內(nèi)使用

[方法]

A．噬菌體的注射以及組織的制備

1．通過腹腔注射300～500ul的1．25％（w/v）阿佛丁來(lái)麻醉小鼠。

2．將鼠尾置于溫水中，使尾部血管膨脹。

3．用另外的胰島素注射器注射200g1的噬菌體溶液。

4．讓噬菌體循環(huán)至少5分鐘。

5．打開胸腔并暴露心臟。

6．用10～20m1冷的新配制的4％PFA來(lái)灌注動(dòng)物。

7．將大塊的器官或腫瘤取出并切成小塊，并把它們浸泡于4％PFA中。在PFA中固定的時(shí)間不能超過24小時(shí)。

8．在一臺(tái)自動(dòng)組織脫水機(jī)（Tissue—Tek VIP；Miles Scientific）  中處理組織。

9．用石蠟包埋樣品并切成5um的切片。

B．抗原的獲取與封閉

1．用3％（體積分?jǐn)?shù)）的過氧化氫（H202）PBS溶液在室溫下孵育15分鐘，以除去內(nèi)源性過氧化物酶活性。用lXPBS洗滌兩次。   

2．用胰酶（ZymedLaboratories，Inc．）在37℃消化10分鐘來(lái)暴露抗原位點(diǎn)。用lXPBS

  洗滌3次。

3．用抗生物素蛋白（avidin）/生物素（biotin）封閉試劑盒（Vecto rLaboratories）來(lái)封閉內(nèi)源性抗生物素蛋白和生物素的活性。

4．如果使用DAKO抗體稀釋液，則不需進(jìn)行蛋白封閉。

C．抗體和復(fù)染

1．用DAKO抗體稀釋液來(lái)稀釋一抗（對(duì)于多抗比例為1：1000），并添加約100ul到切片中（足夠*覆蓋切片的量）。在宅溫下孵育1小時(shí)，用1XPBS洗滌切片兩次。

2．向切片中添加大約100/11（足夠*覆蓋切片的量）的預(yù)先稀釋的多克隆二抗。在室溫下孵育30分鐘，用1×PBS洗滌切片兩次。

3．向切片中添加100gl的DAB底物溶液，并在室溫下孵育4～6分鐘。

4．用Harris蘇木精（Surgipath）在室溫下復(fù)染3分鐘，用自來(lái)水洗滌一次，脫水并用丙烯酸樹脂組織切片固定劑（mounting media）（Cytoseal 60；EMS）封片。

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