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Rat Estradiol ELISA Kit
 
Catalog No. CSB-E05110r
（96T）
 
 
 
 
  This  immunoassay  kit  allows  for  the  in  vitro  quantitative  determination  of  rat  Estradiol
concentrations in serum, plasma and other biological fluids.
  Expiration date      six months from the date of manufacture
  FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES.
 
 
 
 
 
CUSABIO BIOTECH CO., LTD.
http://www.cusabio.com/    http://www.cusabio.cn/
: cusabio@cusabio.com    cusabio@cusabio.cn 
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INTRODUCTION
Estradiol （E2 or 17β-estradiol） （also oestradiol） is a sex hormone. During
the  reproductive  years,  most  estradiol  in  women  is  produced  by  the
granulosa  cells  of  the  ovaries  by  the  aromatization  of  androstenedione
（produced in the theca folliculi cells） to estrone, followed by conversion
of estrone to estradiol by 17β-hydroxysteroid reductase. Smaller amounts
of estradiol are also produced by the adrenal cortex, and （in men）, by the
testes.  Estradiol  is  not  only  produced  in  the  gonads:  in  both  sexes,
precursor  hormones,  specifically  testosterone,  are  converted  by
aromatization  to  estradiol.  In  particular,  fat  cells  are  active  to  convert
precursors to estradiol, and will continue to do so even after menopause.
Estradiol  is  also  produced  in  the  brain  and  in  arterial  walls.  Estradiol
enters  cells  freely  and  interacts with  a  cytoplasmic  target  cell  receptor.
When the estrogen receptor has bound its ligand it can enter the nucleus
of  the  target  cell,  and  regulate  gene  transcription  which  leads  to
formation  of messenger  RNA.  The mRNA  interacts with  ribosomes  to
produce  specific  proteins  that  express  the  effect  of  estradiol  upon  the
target cell. Estradiol binds well to both estrogen receptors, ERα and ERβ,
in  contrast  to  certain  other  estrogens,  notably  medications  that
preferentially act on one of these receptors. These medications are called
selective estrogen receptor modulators, or SERMs. 
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PRINCIPLE OF THE ASSAY
The  microtiter  plate  provided  in  this  kit  has  been  pre-coated  with  an
goat-anti-rabbit  antibody.  Standards  or  samples  are  then  added  to  the
appropriate microtiter  plate wells with  a HRP-conjugated Estradiol  and
antibody  preparation  specific  for Estradiol  and  incubated. Then  a TMB
（3,3',5,5' tetramethyl-benzidine） substrate solution is added  to each well.
The  enzyme-substrate  reaction  is  terminated  by  the  addition  of  a
sulphuric  acid  solution  and  the  color  change  is  measured
spectrophotometrically  at  a  wavelength  of  450  nm  ±  2  nm.  The
concentration  of  Estradiol  in  the  samples  is  then  determined  by
comparing the O.D. of the samples to the standard curve.
DETECTION RANGE
20  pg/ml-1000  pg/ml.  The  standard  curve  concentrations  used  for  the
ELISA’s were 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 200 pg/ml, 60 pg/ml, 20 pg/ml.
SPECIFICITY
This  assay  recognizes  recombinant  and  natural  rat  Estradiol.  No
significant cross-reactivity or interference was observed. 
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SENSITIVITY
The  minimum  detectable  dose  of  rat  Estradiol  is  typically  less  than  5
pg/ml.
The  sensitivity  of  this  assay,  or  Lower  Limit  of Detection  （LLD） was
defined  as  the  lowest  protein  concentration  that  could  be  differentiated
from zero.
MATERIALS PROVIDED
Reagent      Quantity
Assay plate  1（96T）
Standards （S1-S5）  5  
HRP-conjugate  1 x 6ml
Antibody  1 x 6 ml
Wash Buffer      
1 x 15 ml
  （20×concentrate）
Substrate A  1 x 7ml
Substrate B  1 x 7 ml
Stop Solution      1 x 7 ml
Standard    Standard 1  Standard 2  Standard 3  Standard 4  Standard 5
Concentration
（pg/ml）
20pg/ml  60pg/ml  200pg/ml  500pg/ml  1000pg/ml 
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STORAGE
1.  Unopened  test  kits  should  be  stored  at  2-8°C  upon  receipt  and  the
microtiter  plate  should  be  kept  in  a  sealed  bag  with  desiccants  to
minimize exposure  to damp air. The  test kit may be used  throughout
the  expiration  date  of  the  kit.  Refer  to  the  package  label  for  the
expiration date.
2.  Opened  test  kits  will  remain  stable  until  the  expiring  date  shown,
provided it is stored as prescribed above.    
3.  A microtiter  plate  reader with  a  bandwidth  of  10 nm  or  less  and  an
optical  density  range  of  0-3 OD  or  greater  at  450nm wavelength  is
acceptable for use in absorbance measurement.
TECHNICAL HINTS
1.  Bring  all  reagents  and  plate  to  room  temperature  for  at  least  30
minutes  before  use.  Unused  wells  need  store  at  2-8  ℃and  avoid
sunlight.
2.  Wash Buffer    If  crystals  have  formed  in  the  concentrate, warm  to
room  temperature  and mix  gently  until  the  crystals  have  compley
dissolved. Dilute 15 ml of Wash Buffer Concentrate into deionized or
distilled water to prepare 300 ml of Wash Buffer. 
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3.  To  avoid  cross-contamination,  change pipette  tips between  additions
of  each  standard  level,  between  sample  additions,  and  between
reagent additions. Also, use separate reservoirs for each reagent.
4.  When  using  an  automated  plate  washer,  adding  a  30  second  soak
period following the addition of wash buffer, and/or rotating the plate
180 degrees between wash steps may improve assay precision.
5.  To  ensure  accurate  results,  proper  adhesion  of  plate  sealers  during
incubation steps is necessary. Sealers can not be reused.
6.  Substrate  Solution  should  remain  colorless  until  added  to  the  plate.
Keep  Substrate  Solution  protected  from  light.  Substrate  Solution
should change from colorless to gradations of blue.
7.  Stop Solution  should  be  added  to  the plate  in  the  same  order  as  the
Substrate  Solution. The  color  developed  in  the wells will  turn  from
blue  to  yellow  upon  addition  of  the  Stop  Solution. Wells  that  are
green  in  color  indicate  that  the  Stop  Solution  has  not  mixed
thoroughly with the Substrate Solution.
Precaution: The Stop Solution provided with this kit is an acid solution. Wear eye,
hand, face, and clothing protection when using this material. 
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OTHER SUPPLIES REQUIRED
  Microplate  reader capable of measuring absorbance at 450 nm, with
the correction wavelength set at 540 nm or 570 nm.
  Pipettes and pipette tips.
  Deionized or distilled water.
  Squirt bottle, manifold dispenser, or automated microplate washer.
SAMPLE COLLECTION AND STORAGE
  Serum    Use a serum separator tube （SST） and allow samples to clot
for  30  minutes  before  centrifugation  for  15  minutes  at  1000  x  g.
Remove serum and assay immediay or aliquot and store samples at
-20° C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
  Plasma    Collect  plasma  using  citrate,  EDTA,  or  heparin  as  an
anticoagulant.  Centrifuge  for  15  minutes  at  1000  x  g  within  30
minutes  of  collection.  Assay  immediay  or  aliquot  and  store
samples at -20° C. Avoid repeated freeze-thaw cycles.
Note: Grossly hemolyzed samples are not suitable for use in this assay.
ASSAY PROCEDURE
Bring all reagents and samples to room temperature before use. It is recommended
that all samples, standards, and controls be assayed in duplicate. 
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1.  Set  a  Blank  well  without  any  solution.  Add  50l  of  Standard  or
Sample per well. Standard need test in duplicate.  
2.  Add 50l of HRP-conjugate  to each well  （not  to Blank well）,  then
50l antibody to each well. Mix well and then incubate for 2 hours at
37°C.  
3.  Fill  each well with Wash Buffer  （about 200l）,  stay  for 10  seconds
and  Spinning.  Repeat  the  process  for  a  total  of  three  washes.
Complete  removal  of  liquid  at  each  step  is  essential  to  good
performance. After the last wash, remove any remaining Wash Buffer
by  aspirating or decanting.  Invert  the plate  and blot  it  against  clean
paper towels.
4.  Add 50l of Substrate A  and Substrate B  to  each well, mix well.
Incubate for 15 minutes at 37°C. Keeping the plate away from drafts
and other temperature fluctuations in the dark.
5.  Add  50l  of  Stop  Solution  to  each well.  If  color  change  does  not
appear uniform, gently tap the plate to ensure thorough mixing.
6.  Determine the optical density of each well within 10 minutes, using a
microplate reader set to 450 nm. 
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CALCULATION OF RESULTS
Average the duplicate readings for each standard, Blank, and sample and
subtract the optical density of Blank. Create a standard curve by reducing
the data using computer software capable of generating a four parameter
logistic （4-PL） curve-fit. As an alternative, construct a standard curve by
plotting the mean absorbance for each standard on the y-axis against the
concentration on  the x-axis and draw a best  fit curve  through  the points
on  the  graph.  The  data  may  be  linearized  by  plotting  the  log  of  the
Estradiol  concentrations versus  the  log of  the O.D.  and  the best  fit  line
can be determined by regression analysis. This procedure will produce an
adequate but less precise fit of the data. If samples have been diluted, the
concentration  read  from  the  standard  curve must  be multiplied  by  the
dilution factor.
LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
  The kit should not be used beyond the expiration date on the kit label.
  Do  not  mix  or  substitute  reagents  with  those  from  other  lots  or
sources.
  It is important that the Calibrator Diluent selected for the standard
curve be consistent with the samples being assayed. 
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  If samples generate values higher than the highest standard, dilute the
samples with the appropriate Calibrator Diluent and repeat the assay.
  Any  variation  in  Standard  Diluent,  operator,  pipetting  technique,
washing  technique,  incubation  time  or  temperature,  and  kit  age  can
cause variation in binding.
  This assay is designed to eliminate interference by soluble receptors,
binding  proteins,  and  other  factors  present  in  biological  samples.
Until all factors have been tested in the Quantikine Immunoassay, the
possibility of interference cannot be excluded.
     
     
     
     
     
     
     
     
     
      
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大鼠 大鼠 大鼠 大鼠雌二醇 雌二醇 雌二醇 雌二醇酶聯(lián)免疫 酶聯(lián)免疫 酶聯(lián)免疫 酶聯(lián)免疫試劑盒 試劑盒 試劑盒 試劑盒     
使用說(shuō)明書(shū) 使用說(shuō)明書(shū) 使用說(shuō)明書(shū) 使用說(shuō)明書(shū)     
本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用 本試劑盒僅供研究使用
產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào) 產(chǎn)品編號(hào)：CSB-E05110r
檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍 檢測(cè)范圍： ：： ：20 pg/ml -1000 pg/ml
特異性 特異性 特異性 特異性： ：： ：本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)天然或重組的雌二醇，且與其他相關(guān)物質(zhì)基本
無(wú)交叉反應(yīng)。
有效期 有效期 有效期 有效期：6 個(gè)月（2-8℃避光保存）
預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用 預(yù)期應(yīng)用： ：： ：ELISA 法定量測(cè)定大鼠血清，血漿及其它相關(guān)生物液體中雌二醇
含量。
說(shuō)明 說(shuō)明 說(shuō)明 說(shuō)明  
1.  濃洗滌液低溫保存會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。  
2.  剛開(kāi)啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)
結(jié)果造成任何影響。
實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理 實(shí)驗(yàn)原理
采用酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)雌二醇含量。首先用羊抗兔包被微孔板，制備成
固相二抗，然后加入待測(cè)標(biāo)本、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的雌二醇以及抗雌二醇抗
體，使之形成包被二抗-抗雌二醇抗體-雌二醇（HRP）復(fù)合物。經(jīng)顯色后在酶標(biāo)
儀測(cè)定吸光值（OD值），通過(guò)計(jì)算機(jī)或作圖擬合濃度-吸光度曲線，反算出待測(cè)
標(biāo)本中雌二醇含量。 
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試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制 試劑盒組成及試劑配制  
1.  酶 酶酶 酶聯(lián) 聯(lián)聯(lián) 聯(lián)板 板板 板（Assay plate ）：                                                                       一塊 （96 孔）。   
2.  標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品（Standard）：                                                                                      5 瓶。 
Standard 1  Standard 2  Standard 3  Standard 4  Standard 5
20pg/ml  60pg/ml  200pg/ml  500pg/ml  1000pg/ml
3.  酶結(jié)合物 酶結(jié)合物 酶結(jié)合物 酶結(jié)合物（ （（ （HRP-conjugate） ）） ）：                                                              1×6ml/瓶。 
4.  抗體 抗體 抗體 抗體（ （（ （Antibody） ）） ）：                                                                                1×6ml/瓶。 
5.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 A（ （（ （Substrate A）：                                                                    1×7ml/瓶。 
6.  顯色劑 顯色劑 顯色劑 顯色劑 B（ （（ （Substrate B）：                                                                    1×7ml/瓶。 
7.  濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液 濃洗滌液（ （（ （Wash Buffer） ）） ）：        1×15ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 20 倍。   
8.  終止液 終止液 終止液 終止液（ （（ （Stop Solution） ）） ）：                                                                      1×7ml/瓶。 
需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材 需要而未提供的試劑和器材
1.  標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀
2.  高速離心機(jī)
3.  電熱恒溫培養(yǎng)箱
4.  干凈的試管和 Eppendof管
5.  系列可調(diào)節(jié)移液器及吸頭，一次檢測(cè)樣品較多時(shí)，用多通道移液器
6.  蒸餾水，容量瓶等
標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存 標(biāo)本的采集及保存
1.  血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜后于 1000 x g離心 20 分鐘，
取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.  血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8° C 1000
x g 離心 15 分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注 注注 注： ：： ：以上標(biāo)本置 以上標(biāo)本置 以上標(biāo)本置 以上標(biāo)本置 4℃ ℃℃ ℃保存應(yīng)小于 保存應(yīng)小于 保存應(yīng)小于 保存應(yīng)小于 1 周 周周 周， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃或 或或 或-80℃ ℃℃ ℃均應(yīng)密封保存 均應(yīng)密封保存 均應(yīng)密封保存 均應(yīng)密封保存， ，， ，-20℃ ℃℃ ℃不應(yīng)超過(guò) 不應(yīng)超過(guò) 不應(yīng)超過(guò) 不應(yīng)超過(guò) 1 個(gè)月 個(gè)月 個(gè)月 個(gè)月， ，， ，
-80℃ ℃℃ ℃不應(yīng)超過(guò) 不應(yīng)超過(guò) 不應(yīng)超過(guò) 不應(yīng)超過(guò) 2 個(gè)月 個(gè)月 個(gè)月 個(gè)月； ；； ；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果， ，， ，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè) 因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。 。。 。 
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操作步驟 操作步驟 操作步驟 操作步驟
1.  將各種試劑至室溫〔18-25℃〕平衡半小時(shí)，取濃縮洗滌液，根據(jù)當(dāng)批檢測(cè)
數(shù)量，用蒸餾水上 1：20 稀釋，混勻后備用。
2.  將酶標(biāo)板取出，設(shè)一個(gè)空白對(duì)照孔、不加任何液體；每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)依次各設(shè)兩
孔，每孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品 50ul；其余每個(gè)檢測(cè)孔直接加待測(cè)標(biāo)本 50ul。  
3.  每孔加入酶結(jié)合物 50ul（空白對(duì)照孔除外），再按同樣順序每孔加入抗體
50ul，充分混勻，貼上不干膠封片，置 37℃溫育 2 小時(shí)。
4.  手工洗板，棄去孔內(nèi)液體。洗滌液注滿各孔，靜置 10 秒甩干，重復(fù)三次后
拍干；洗板機(jī)洗板，選擇洗滌三次程序，洗板后拍干。
5.  每孔加顯色劑 A 液 50μl，顯色劑 B 液 50μl，振蕩混勻后，37℃避光顯色
15 分鐘，每孔加終止液 50μl。
6.  用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長(zhǎng) 450nm，先用空白孔調(diào)零點(diǎn)，然后測(cè)定各孔 OD值。
數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理
1.  手工作圖：用雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫軸，以對(duì)應(yīng)的 0D值為縱軸，
畫(huà)出平滑曲線或直線，在曲線上按照待測(cè)血清 OD值找到對(duì)應(yīng)的濃度值。
2.  計(jì)算機(jī)：使用線性擬合功能，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)品 S1-S5 的濃度取對(duì)數(shù)（Log（濃度））
作為 X，將對(duì)應(yīng)的 OD值減去空白對(duì)照孔 OD 值后取對(duì)數(shù) （Log（OD值-NSB））
作為 Y，進(jìn)行線性擬合。再?gòu)臄M合線上計(jì)算出待測(cè)血清濃度。
注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)
1.  從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內(nèi)全部瓶裝試劑及所需預(yù)包被板條應(yīng)置室溫
（18-25℃）平衡 30 分鐘后方可使用，余者應(yīng)及時(shí)封好口，放回 2-8℃中避光保
存，以備后用。
2.  使用前試劑應(yīng)搖勻。
3.  結(jié)果判斷須在反應(yīng)終止后 10 分鐘內(nèi)完成。
4.  不同批號(hào)的試劑不可混用。
5.  加樣時(shí)應(yīng)注意避免所用各試劑及樣品之間的交又污染。
6.  操作時(shí)，試劑盒內(nèi)每種試劑各使用一個(gè)吸頭，每一種標(biāo)準(zhǔn)品使用一個(gè)吸頭，
每一個(gè)樣品各使用一個(gè)吸頭，吸頭一次性使用。        
 

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