胰島素ELISA試劑盒

（德國DRG：EIA2935）

1、前言說明

DRG公司的胰島素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中（加入了肝素或檸檬酸的血漿）胰島素的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。

胰島素是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的主要激素，它由朗格漢氏小島的β細(xì)胞合成分泌，并以前胰島素的前體形式存在，前胰島素可加工形成C肽和胰島素。這兩種激素都以等量形式分泌到門脈循環(huán)中。成熟的胰島素分子由兩條多肽鏈組成，A鏈和B鏈（分別21個(gè)和30個(gè)氨基酸）。這兩條鏈通過鍵內(nèi)二硫鍵而連接到一起。胰島素的分泌主要受血漿葡萄糖濃度的影響，這種激素有一系列重要的代謝功能。它的主要功能是通過葡萄糖的運(yùn)送來控制外周組織中葡萄糖的攝取和利用。胰島素和其它低血糖激素的作用（如抑制肝糖原的異生和糖原分解）可被高血糖激素（胰高血糖素，腎上腺素，生長激素和皮質(zhì)醇）的作用中和掉。在胰島素依賴性的糖尿病（IDDM）和其它疾病例如垂體機(jī)能減退疾病中,胰島素的濃度會明顯降低。在非胰島素依賴性的糖尿病患者、肥胖患者、胰島素瘤患者和一些內(nèi)分泌功能紊亂（如庫欣綜合癥和支端肥大癥）患者的體內(nèi)，其胰島素的水平會上升。

2、實(shí)驗(yàn)原理

DRG公司的胰島素酶免實(shí)驗(yàn)是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）,反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合胰島素分子上*抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性胰島素的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種生物素標(biāo)記的抗胰島素抗體。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。在第二次溫育時(shí)，鏈親和素過氧酶復(fù)合物結(jié)合到生物素化抗胰島素抗體上，過氧酶復(fù)合物的結(jié)合量與樣品中胰島素的濃度成正比。加入底物液后，所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中胰島素的濃度成正比。

3、試劑盒成分

1）       微孔板：12×8，96孔，包被抗胰島素的單克隆抗體。

2）       零標(biāo)準(zhǔn)品 ：1支，3ml，即用，0μIU/ml。

3）       標(biāo)準(zhǔn)品1－5：5支，1ml，即用，6.25;12.5;25;50;100μlU/ml。

4）       酶聯(lián)物：1支，5ml，即用，生物素化的鼠單克隆抗體。

5）       酶復(fù)合物：1支，7ml，即用，辣根過氧化物-鏈親和素復(fù)合物。

6）       TMB底物液：1支 14ml 即用。

7）       終止液： 1支 14ml 即用 包含0.5M硫酸,請勿接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。

8）       洗滌液：1瓶，30ml，40倍濃縮，見試劑準(zhǔn)備。

注意：用樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品視需要而定。

4、實(shí)驗(yàn)所需材料（但試劑盒不提供）

1）  酶標(biāo)儀

2）  標(biāo)準(zhǔn)移液器

3）  吸水紙

4）  蒸餾水

5、試劑的儲存與穩(wěn)定性

所有的未開啟的試劑在2－8℃下儲存至保質(zhì)期，不要使用過期的試劑。所有開啟的試劑應(yīng)在2－8℃下儲存。一旦打開微孔板的包裝，需將其重新密封。

6、樣品的準(zhǔn)備

將所有的試劑和所需要的板條在使用前平衡至室溫。

洗滌液：用1170ml的蒸餾水稀釋30ml濃縮的洗滌液，zui終得到的容積為1200ml，稀釋好的洗滌液在室溫下可穩(wěn)定存放兩個(gè)星期。

7、樣品的收集

此ELISA試劑盒可使用血清也可使用（只有肝素或檸檬酸鹽抗凝的血漿）血漿作為樣品。

不能使用明顯溶血﹑黃疸和脂血的樣品。

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。

血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。

8、樣品的儲存：

樣品蓋好蓋子后，可在實(shí)驗(yàn)前2-8℃下儲存5天，要更長時(shí)間儲存，應(yīng)在-20℃下凍存。在開始實(shí)驗(yàn)前應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品。

9、樣品的稀釋：

在*次實(shí)驗(yàn)中，要是樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品，則樣品應(yīng)用按實(shí)驗(yàn)步驟所描述的10倍或100倍稀釋。在計(jì)算濃度時(shí)需乘以此稀釋度。

例子：

a）  按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）。

b）  按1：100釋稀：10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）

10、實(shí)驗(yàn)步驟

所有的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有微孔的檢測條件都一樣。

1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。。

2）用一次性吸嘴將標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和樣品分別25μL加入相應(yīng)的檢測孔中。

3）每孔加入25μL的酶聯(lián)物。

4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。

5）室溫下溫育30分鐘。

6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和度。

7）每孔加入50μL的酶復(fù)合物。

8）在室溫下溫育30分鐘。

9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

10）每孔加入50μL的底物液。

11）在室溫下溫育15分鐘。

12）每孔加入50μL的終止液終止反應(yīng)。

13）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。

11、計(jì)算結(jié)果：

1）     計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和病人樣品的平均吸光度。

2）     以吸光率為Y軸，濃度為X軸，按照從標(biāo)準(zhǔn)品中獲得的平均吸光率和其相對應(yīng)的濃度值，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）     利用樣品的平均吸光率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出其相應(yīng)的濃度值，

4）     自動方法：使用計(jì)算機(jī)三次方模式﹑四參數(shù)模式或雙對數(shù)函數(shù)的計(jì)算機(jī)程序可得到結(jié)果。

5）     樣品的濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上直接獲取。樣品的濃度高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品的濃度則需進(jìn)一步稀釋。在計(jì)算濃度的時(shí)候，要乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

下面是胰島素ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線的典型例子。

參考值：

建議各實(shí)驗(yàn)室建立自己的正常值與非正常值。

在一明顯正常成年人的研究中，用DRG公司的胰島素ELISA試劑盒進(jìn)行檢測得到如下數(shù)值：2-25μIU/ml

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

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