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去甲腎上腺素ELISA Kit使用說明書

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深圳市科潤達生物工程有限公司
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去甲腎上腺素ELISA Kit使用說明書

（德國IBL：RE59261）

1、應用范圍

此試劑盒可用于人血清和尿液中去甲腎上腺素的體外定量檢測。

2、臨床意義

兒茶酚胺類激素腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺主要由腎上腺髓質、交感神經系統(tǒng)和大腦產生。它們幾乎影響所有的組織，并與其它激素和神經系統(tǒng)一起參與各種生理過程的調節(jié)。在許多疾病中，兒茶酚胺激素及其代謝產物變腎上腺素和去甲變腎上腺素的分泌量都會增加，因而這些激素可用于疾病的診斷。所以，這些激素的檢測對于疾病的診斷及神經系統(tǒng)腫瘤疾病的具有重要意義。它主要用于嗜鉻細胞瘤的診斷，當然也用于成神經細胞瘤和神經節(jié)細胞瘤的診斷。因為在實驗一開始時有提取步驟，用戶可使用各種動物材料進行實驗。所有動物的兒茶酚胺的化學結構相同，因此此試劑盒可用于測大鼠、小鼠或其它動物。

3、實驗原理

此固相ELISA試劑盒利用的夾心法原理。微孔中包被了羊抗兔抗體。之后加入的液態(tài)抗體可以結合到抗原分子的一個抗原決定簇上，而抗原分子可在溫育期內結合到固相抗體上。樣品中的抗原與酶標二抗一起在微孔內溫育，此酶標二抗可結合到抗原分子上的另一不同表位上。加入底物液后，溶液所顯示的顏色強度與樣品中抗原的量成正比。樣品的結果可直接從標準曲線上讀取。

4、貯存與穩(wěn)定性

試劑盒和運輸環(huán)境和儲存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽直射。樣品的儲存與穩(wěn)定性及試劑的準備將在相關章節(jié)中闡述。開封的試劑盒在有效期內穩(wěn)定，前提是將試劑盒用袋子密封并儲存于2-8℃的環(huán)境下。

5、樣品的采集與儲存

注意	人體內的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時內病人應禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。

血漿（EDTA）

注意	血液采集后兩小時內，將血液樣品冷藏于2-8℃的環(huán)境下直致離心獲取血漿。
注意靜脈穿刺采集全血的常規(guī)注意事項。從采集到血液樣品的那一刻起到檢測時都應保持血液樣品的化學整體性。不要使用明顯溶血、黃疸的和脂血樣品。如果樣品出現(xiàn)混濁，則在實驗前應當離心以除去所有的微粒物質。
貯存	2-8℃	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。
穩(wěn)定性	6h	1個月

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。將病人24h內的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐劑的試劑瓶中。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復凍融，冷凍狀態(tài)下運輸樣品。
穩(wěn)定性	6個月

6、試劑盒成分

注意：試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測所需的試劑成分

數(shù)量	標志	成分
1×12×8	MTP	包被板，可拆，微孔中包被了抗兔IgG（羊，單克?。?。
1×6×2.5ml	CAL A-F	標準品A-F，即用腎上腺素:0;1.5;15;50;150ng/ml（0;8;27;82;273;819nmol/L）去甲腎上素:0;5;15;50;150;500ng/mL（0;30;89;296;887;2955nmol/L）多巴胺:0;12;35;115;450;2250ng/mL（0;78;228;750;2938;14688nmol/L）內含[-]腎上腺素，[-]去甲腎上腺素，[-]多巴胺（有生物活性）,0.1M的HCl
1×2×2.5ml	CONTROL 1+2	質控品1+2 即用,含: [-]腎上腺素，[-]去甲腎上腺素，[-]多巴胺（具有生物活性）,0.1M的HCl,具體濃度及可允許范圍請見試劑瓶標簽.
1×250μL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物濃縮型（100×）內含：堿性磷酸酶標記的抗體，Tris緩沖液，HCl，0.01%的NaN3
2×	EXTRPLATE	提取板（微孔板）每板24孔，包被了硼酸親和凝膠。
1×60ml	EXTRBUF	提取緩沖液粉紅色，即用，內含：0.016%的NaN3
2×1.25ml	COMT LYO	COMT凍干粉內含：兒茶酚-氧位-甲基轉移酶（豬肝），NaN3
1×2ml	COMT ADD	COMT添加劑內含：人血漿，穩(wěn)定劑，0.01%硫柳汞。
1×7ml	ANTISERUM DO	去甲腎上腺素抗血清紫羅蘭色，即用，內含：抗去甲腎上腺素抗體（兔），緩沖液，穩(wěn)定劑。
2×1.25ml	COENZ	酶聯(lián)復合物即用，內含：S-腺苷-L-蛋白酸，穩(wěn)定劑。
1×3ml	ENZBUF	酶緩沖液即用，內含：Tris緩沖液，HCl，穩(wěn)定劑。
1×17ml	RELEASEBUF	Release緩沖液黃色，即用，內含：0.1M的HCl，指示劑。
1×3ml	ACYLREAG	?；噭?/span> 即用，內含：二甲基甲酰胺，乙醇。注意：有毒，高可燃性。
1×50ml	WASHBUR CONC	洗滌液濃縮型（10×）內含：Tris緩沖液，HCl，吐溫，0.2%的NaN3
1×9×	PNPP SUBS	PNPP底物片內含：對硝基苯磷酸（PNPP）
1×27ml	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液即用，內含：二乙醇胺，水，0.05%的NaN3
1×15ml	PNPP STOP	PNPP終止液即用，內含：1M的NaOH，0.25M的EDTA
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1）移液器（10；10-100；100-1000μL）

2）軌道搖床（200-900rpm）

3）旋渦混合器

4）帶儲器的8通道移液器

5）洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統(tǒng)

6）酶標儀

7）雙蒸水或去離子水

8）吸水紙，取樣吸頭，計時器

8、實驗前說明

注意	用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。，下列所述體積為做48人份時所需要的量。

8.1樣品的稀釋

如果樣品中去甲腎上腺素濃度高于zui高標準品的應按照下列所述進行稀釋：

樣品	待稀釋	稀釋液	備注
血漿	去甲腎上腺素濃度高于zui高標準品中去甲腎上腺素的濃度	雙蒸水	提取步驟前
尿液	去甲腎上腺素濃度高于zui高標準品中去甲腎上腺素的濃度	0.1N的HCl	提取步驟前

8.2樣品、標準品和質控品的提?。ㄌ崛“?，手動操作版）

1）	將標準品、已稀釋好的質控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。
2）	在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液
3）	蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
4）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。
5）	每孔加入2ml雙蒸水
6）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
7）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。
8）	每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL?；噭?，立即混合均勻。
9）	在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環(huán)境下提取20min。（無需蓋板）
10）	快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。
11）	每孔加入2ml雙蒸水。
12）	用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環(huán)境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。
13）	移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。
14）	每孔加入300μL Release緩沖液。
15）	在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環(huán)境下振蕩30min。（無需蓋板）

已準備好的樣品應當在當天就進行檢測。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環(huán)境下可存放一夜。

9、實驗步驟

9.1 COMT酶溶液的準備

注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置。

在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯(lián)溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液zui后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩(wěn)定存放1小時。

*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應立即凍存于-20℃的環(huán)境下。COMT溶液可在此環(huán)境下穩(wěn)定存放1-2個月。

9.2樣品、標準品和質控品的酶分化

注意	如果要檢測腎上腺素和去甲腎上腺素，我們建議您先檢測腎上腺素。如果使用自動置換型衣液器加樣，請將取樣吸頭內的殘余液體加入到提取板的相應微孔內，否則剩余的提取液不夠去甲腎上腺素檢測用。將提取板放到有一定坡度的位置上。實驗開始前，確定好腎上腺素和去甲腎上腺素的檢測孔并標記好。

9.3尿液與血漿中的去甲腎上腺素

1	在每一微孔內加入25ul臨時配制的COMT酶溶液，輕輕振板以使溶液混合均勻。
2	將提取好的標準品、質控品和樣品分別25ul加入到相應的微孔內。在此步驟中，我們可以將取樣吸頭直接深入到COMT溶液里。加樣后，溶液顏色變成粉色，輕輕振板以使溶液混合均勻。
3	向每一微孔中加入50ul去甲腎上腺素抗血清（藍色）。
4	蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育120min。

8.4凍干粉或濃縮成分的準備

稀釋	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
20ml	洗滌液	180ml	雙蒸水	1：10	充分混合	2-8℃	4W
60μL	酶聯(lián)物	6ml	洗滌緩沖液（已稀釋好）	1：101	臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產生	18-25℃	30min
4	PNPP底物片	10.7ml	PNPP底物緩沖液		臨時配置，僅能使用一次	18-25℃	10min

9.5 ELISA實驗步驟

1）移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250-300ul稀釋好的洗滌液洗板4次。zui后在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

2）在每一微孔中加入100ul臨時配置好的酶聯(lián)物。

3）蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育60min。

4）移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250-300ul稀釋好的洗滌液洗板4次。zui后在吸水紙上拍干一除去殘余液體。

5）如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時間間隔應當相同，使用自動置換型移液器并避免氣泡產生。

6）在每一微孔中加入200ul底物液。

7）不要蓋板，在軌道搖床上（400-600rpm）18-25℃的環(huán)境下孵育60min。

8）在每一微孔內加入50ulPNPP終止液以終止酶反應。輕輕振板以使溶液混合均勻。

9）加終止液后60min內405nm處讀取OD值。

10、期望值

實驗結果不能當作判斷任何治療結果的*因素，疾病的判斷還應當與其它臨床觀察和診斷檢測相結合。以下結果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個實驗室讀確定自己的正常值范圍：

	尿液		血漿
	μg/d	nmol/d	pg/mL	nmol/L
去甲腎上腺素	＜90	＜535	＜600	＜3.55

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

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