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毛細(xì)管區(qū)帶電泳色譜儀分析技術(shù)
毛細(xì)管區(qū)帶電泳色譜儀（CZE）又稱(chēng)自由溶液區(qū)帶電泳儀，整個(gè)系統(tǒng)采用同一種緩沖液充滿(mǎn)，以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，利用荷電粒子之間的淌度差異進(jìn)行分離。
一、工作原理：
CZE中，粒子的電荷性質(zhì)不同，電泳方向不同；粒子的電荷數(shù)量不同，電泳速度不同；粒子的分子量不同，電泳速度不同。在毛細(xì)管中，由于電滲流的存在，所有粒子都隨電滲流一起向負(fù)極遷移，電滲流速度約是一般離子電泳速度的5～7倍。各種電性粒子在毛細(xì)管中的遷移速度分別為：
1、陽(yáng)離子：vap = veo+ vep，陽(yáng)離子電泳方向與電滲流方向一致。
2、陰離子：vap = veo－vep，陰離子電泳方向與電滲流方向相反。
3、中性粒子：vap = veo，中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流方向一致。
當(dāng)樣品從陽(yáng)注入毛細(xì)管時(shí)，不同電性的粒子將按不同速度向負(fù)極遷移，從負(fù)先后流出毛細(xì)管，出峰順序依次是陽(yáng)離子、中性粒子和陰離子。中性粒子無(wú)電泳現(xiàn)象，隨電滲流同行，在陽(yáng)離子后流出，但不同結(jié)構(gòu)的中性粒子無(wú)法相互分離（電泳圖上是一個(gè)峰）。
電滲流在CZE中起著極其重要的作用：
1、電滲流具有象HPLC中泵一樣的作用，推動(dòng)粒子前進(jìn)，加上不同粒子電泳速度和方向的差異，完成陽(yáng)離子、陰離子和中性粒子的分離。
2、改變電滲流速度的大小和方向，可改變分離效率和選擇性。這是CZE優(yōu)化分離的重要因素。
3、電滲流速度的微小變化會(huì)影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時(shí)間和峰面積）。
二、特點(diǎn)：
1、毛細(xì)管不涂敷任何固定液。
2、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，操作方便。
3、不能分離電中性組分，因?yàn)殡娭行越M分的淌度差為零。
4、不能分離質(zhì)荷比相近的組分，如蛋白質(zhì)－SDS絡(luò)合物。
三、定性和定量分析：
1、定性依據(jù)：不同組分的遷移時(shí)間不同。
2、定量依據(jù)：電泳峰面積或峰高。
四、操作條件：
CZE操作條件包括緩沖液、添加劑、分離電壓和分離溫度等選擇。
1、緩沖液：
CZE分離過(guò)程在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液的選擇直接影響粒子的遷移和分離。
配制緩沖液時(shí)，必須使用高純蒸餾水和試劑。使用前要用0.45μm濾膜過(guò)濾以除去顆粒等。
（1）選擇緩沖液應(yīng)遵循的條件：
1）在所選擇的pH范圍內(nèi)有很好的緩沖容量。
2）在檢測(cè)波長(zhǎng)處無(wú)吸收或吸收值低。
3）為達(dá)到有效的進(jìn)樣和合適的電泳淌度，緩沖液pH值至少與被測(cè)組分的等電點(diǎn)相差l個(gè)pH單位。
4）自身淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。
5）只要條件允許，盡可能采用酸性緩沖液。在低pH值下，吸附和電滲流都很小，毛細(xì)管涂層的壽命較長(zhǎng)。
6）與毛細(xì)管種類(lèi)匹配，涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用。
?。?）緩沖液pH值的選擇：
1）緩沖液pH值的選擇與樣品性質(zhì)有關(guān)。
?、偻ǔＫ嵝越M分選擇在堿性條件下分離。
?、谕ǔA性組分選擇在酸性條件下分離。
?、鄣鞍踪|(zhì)、多肽和氨基酸等兩性物質(zhì)可選酸性（pH = 2）或堿性（pH＞9）分離介質(zhì)。
?、芴穷?lèi)樣品通常在pH = 9～11能獲得*分離。
?、蒴人峄蚱渌鼧悠范嘣趐H = 5～9選擇分離條件。
2）緩沖液pH值的選擇和毛細(xì)管種類(lèi)有關(guān)。
很多涂層毛細(xì)管只能在一定pH范圍內(nèi)使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管只能在pH = 4～9使用，否則涂層易水解失效。
3）在相同pH下，不同緩沖液的分離效果可能相差很大。
一般來(lái)說(shuō)，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是的。如分離糖類(lèi)和DNA等分子時(shí)應(yīng)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖液，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸鹽緩沖液也適用于分離其它含鄰羥基和多羥基的化合物。
4）為了選擇合適的pH值，需要用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)整介質(zhì)的酸堿性。
由于多數(shù)緩沖試劑是酸性物質(zhì)如磷酸，所以pH調(diào)節(jié)劑主要是堿類(lèi)。常用pH調(diào)節(jié)劑有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有機(jī)堿如乙醇胺和乙二胺。如果緩沖試劑為堿類(lèi)，可用酸作為調(diào)節(jié)劑，盡量使用弱酸如H3PO4。
緩沖試劑和調(diào)節(jié)劑的濃度對(duì)改善分離、抑制吸附和控制焦耳熱等都有影響。一般緩沖試劑的濃度在10～200mmol/L，有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)等的吸附作用，濃度可高達(dá)500mmol/L（此時(shí)應(yīng)減少分離電壓）。電導(dǎo)率大的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等的濃度一般在20mmol/L，電導(dǎo)率小的緩沖試劑如硼酸的濃度可在100mmol/L以上。
2、添加劑：
如果緩沖液經(jīng)各種參數(shù)優(yōu)化后仍無(wú)法給出良好的分離結(jié)果，可加入添加劑以改善分離。常用添加劑有：
?。?）無(wú)機(jī)電解質(zhì)：NaCl和KCl等。
?。?）有機(jī)溶劑：甲醇和乙腈等。
?。?）非電解質(zhì)高分子：纖維素、多糖、聚乙烯醇和Triton X－100等。
?。?）功能性添加劑：手性冠醚和環(huán)糊精等。
3、分離電壓：
分離電壓是控制柱效、分離度和遷移時(shí)間的重要因素。分離電壓與毛細(xì)管內(nèi)徑和長(zhǎng)度及緩沖溶液濃度（離子強(qiáng)度）有關(guān)，電壓的極值范圍因系統(tǒng)和組成而異。
當(dāng)柱長(zhǎng)一定時(shí)，在一定電壓范圍內(nèi)，電壓與粒子的遷移速度成線(xiàn)性關(guān)系。
當(dāng)電壓過(guò)高時(shí)，線(xiàn)性關(guān)系偏移，主要是由高電壓引起的焦耳熱造成的。電壓升高，產(chǎn)生的焦耳熱增多，在不能有效驅(qū)散所產(chǎn)生焦耳熱的情況下，柱溫會(huì)顯著升高，工作電流增大，柱效和分離度降低。除了采取有效的散熱措施外，選擇合適的條件，使在此條件下允許使用較高電壓，而不致產(chǎn)生過(guò)大的電流和過(guò)多的焦耳熱，是非常重要的。一般通過(guò)作I－V曲線(xiàn)來(lái)選擇體系的*分離電壓。
4、分離溫度：
毛細(xì)管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對(duì)溫度的限制等因素。
溫度應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定。多數(shù)情況下，在20～30℃進(jìn)行電泳能獲得良好的分離效果。一些糖類(lèi)樣品需要高于室溫的分離條件，一些樣品如蛋白質(zhì)等可能需要低于室溫的分離條件。
五、應(yīng)用：
CZE是CEzui基本、應(yīng)用zui廣的分離模式。
可分離蛋白質(zhì)、多肽和帶電荷的大小分子。