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儀器用具：微量離心機(jī)

 

藥品試劑：

Plasmid DNA 酵解產(chǎn)物： #1 （pBlueGus/HindIII）, #2 （pBlueGus/BamHI）；Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1） 以下簡稱為PCI；Chloroform/isoamyl alcohol （24:1） 以下簡稱為CI；3 M NaOAc （醋酸鈉pH 5.2）；純酒精及70%酒精

 

方法步驟：

◆ 注意！進(jìn)行這一部份實驗的前，請先確定pBlueGus/HindIII 與pBlueGus/BamHI 兩者的酵解反應(yīng)都已經(jīng)*。

1） 于酵解反應(yīng) #1 與 #2 的微量離心管分別加入182 μL 去離子水。

2） 以200 μL PCI 萃取一次，亦即加入PCI 后，以Vortex 震蕩混合，并在室溫離心3 min。

3） 以微量移液器P200 將上層液移至新的微量離心管。

4） 加入等體積的CI，以Vortex 充分震蕩混合，并在室溫離心3 min。

5） 以微量移液器P200 將上層液移至新的微量離心管。

6） 加入0.1 倍體積的3 M NaOAc （pH 5.2） 及2.5 倍體積酒精。

7） 置于 -20℃過夜，或于 -80℃放置30 min，以便沉淀DNA。

隔天：

1） 自冷凍柜取出微量離心管，以14,000 rpm 離心10 min。

?? 注意： 請利用這一段時間參照『基本操作技術(shù)』所描述的步驟準(zhǔn)備一片1.2%洋菜膠體。 Ethidium bromide 是一種強(qiáng)力致癌物質(zhì)，嚴(yán)禁戴著手套到處亂摸！

2） 小心地倒出上清液。

3） 徐徐加入0.5 mL的70%酒精 （預(yù)先放在 -20℃預(yù)冷）。小心不要動到DNA沈淀。

4） 以14,000 rpm 低溫離心5 min 的后，倒去上清液，并將微量離心管倒置于一張干凈的衛(wèi)生紙上30 min，以便風(fēng)干DNA。也可以用SpeedVac 干燥DNA，但應(yīng)小心處理，以免DNA 沉淀不見了。

5） 以10 μL dH2O/DEPC溶解DNA。

6） 依照下表，自pBlueGus/BamHI 與pBlueGus/HindIII 各取1 μL DNA 以洋菜膠體電泳進(jìn)行分析，并估算其濃度。

?? DNA 濃度的估算請以 ??DNA/HindIII 量為參考值。

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質(zhì)體DNA 酵解反應(yīng)與洋菜膠體電泳分析	Southern 轉(zhuǎn)印分析
大腸桿菌抽取RNA	重組質(zhì)體的限制酶分析
Random priming	胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng) （in vitro transcription）
以DIG 標(biāo)定核酸探針	以phenol/chloroform 進(jìn)行DNA 萃取