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[器材和試劑]

● XL1-B1ue或者DHF’TB細(xì)胞

● f1R1噬菌體

● TB

● TBS（tris緩沖鹽水；50mmol/LTris- HCL pH 7．6 ,150mmol/L NaCl，0．05％硫柳汞）

● PEG/NaCl溶液（20％PEG，2，5mol/L NaCl）

● 皮氏培養(yǎng)皿，直徑150mm（Falcon）

● UV Stratalinker 2400（Stratagene）

● 硫柳汞（Sigma）

 

[方法]

1．用來(lái)自備存材料的或直接取自一個(gè)噬菌斑的f1Rl噬菌體，其濃度大約為10⁹個(gè)噬菌斑形成單位（pfu）， 感染2ml XLl-B1ue（Stratagene） 或者DH5。F’TB細(xì)胞。37℃靜止孵育15分鐘，再攪動(dòng)2～3小時(shí)。

2．在一個(gè)2L燒瓶中，將感染混合物稀釋到含有20ug/ml四環(huán)素的800mlTB液中。37℃孵育12-14小時(shí)，劇烈搖動(dòng)（至少150r/min）。

3．用1000m1塑料瓶離心細(xì)菌/噬菌體懸液，10℃下4700r/min 60分鐘。

4．加入PEG 8000（終濃度4％）和NaCl（終濃度0．5mol/L）沉淀噬菌體。*溶解后，冰上放置4小時(shí)或4℃放置過(guò)夜。

5．4700r/min離心60分鐘。小心除去上清。以原體積1/10的TBS溶解沉淀。

6．在上清中加入1/4體積的PEG/NaCl溶液，再次沉淀噬菌體，4℃冰上孵育2小時(shí)。

7．4℃10000r/min離心噬菌體30分鐘，再用10mlTBS重懸噬菌體沉淀。

8．以8000r/min再次離心噬菌體15分鐘，然后去除不溶性部分，以pfu為單位滴定噬菌體。

9．用TBS稀釋已純化的噬菌體至大約每毫升10¹³個(gè)。在269nm處讀取吸光值（A₂₆₉）以測(cè)量每毫升顆粒數(shù)：顆粒數(shù)/m1＝A₂₆₉×稀釋因子× 6×10¹⁶/6407。

10．將每種稀釋比例的噬菌體溶液在各培養(yǎng)皿（直徑150mm） 中滴加20～25ul。可用自動(dòng)分液器（比如Eppendorf 4780）操作，以節(jié)省時(shí)間并避免吸嘴污染。

11．用Stratalinker在200.000uj下，進(jìn)行2～3個(gè)照射循環(huán)。

12．收集已照射的噬菌體，加入0．05％硫柳汞，并按1m1體積分裝，4℃保存。

13．通過(guò)測(cè)量pfu檢查存活的噬菌體。噬菌體滴度應(yīng)當(dāng)?shù)陀诿亢辽?0³個(gè)。