狠狠色丁香久久综合婷婷亚洲成人福利在线-欧美日韩在线观看免费-国产99久久久久久免费看-国产欧美在线一区二区三区-欧美精品一区二区三区免费观看-国内精品99亚洲免费高清

            產(chǎn)品展廳收藏該商鋪

            您好 登錄 注冊

            當(dāng)前位置:
            上海源葉生物科技有限公司>技術(shù)文章>(Random priming)

            技術(shù)文章

            (Random priming)

            閱讀:317          發(fā)布時(shí)間:2011-1-18

            DNA聚合酶要進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)時(shí)一定要有引子 (primer),因?yàn)樗荒芤砸铀峁┑?’-OH為起始點(diǎn)進(jìn)行延伸 (extension) 的工作,而不能就地重新合成新的DNA (de novo synthesis)。 一般實(shí)驗(yàn)常以人工合成的寡核苷酸為引子進(jìn)行DNA聚合反應(yīng),這時(shí)固然可以根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)核酸引子,但也可以采用逢機(jī)引子(random primers)。 所謂逢機(jī)引子即其序列為逢機(jī)序列,不經(jīng)特別設(shè)計(jì),目前應(yīng)用zui廣者是以自動(dòng)化機(jī)器所合成的、六到八個(gè)核苷酸長的寡核苷酸混合物;反應(yīng)進(jìn)行中若有任何一條逢機(jī)引子結(jié)合到模版DNA,即可引導(dǎo)DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)行。 以random priming方法進(jìn)行核酸標(biāo)定,是以逢機(jī)引子引導(dǎo)Klenow fragment(large fragment of E. coli DNA polymerase I) 進(jìn)行DNA聚合反應(yīng),并在反應(yīng)過程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等標(biāo)定物質(zhì)。 而為了避免random priming也發(fā)生于載體部份的DNA,不要直接以質(zhì)體DNA為模版進(jìn)行標(biāo)定反應(yīng),而應(yīng)預(yù)先將目標(biāo)DNA自載體切除出來。

             
            儀器用具:微量離心機(jī);沸水浴及冰浴
             
            藥品試劑:
            模版DNA (pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段,將由助教提供)
            0.2 M EDTA, pH 8.0
            4 M LiCl
            Random priming kit (Roche):
            Hexanucleotide mix (random primer)
            dNTP mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35
            mM DIG-11-dUTP, pH 7.5)
            Klenow enzyme (2 U/μL)
            酒精
            70%酒精
            TE (10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA)
             
            方法步驟:
            ◆ 以下反應(yīng)條件與步驟主要參照random priming kit 制造廠商所提供的產(chǎn)品說明書。
            1) 取100 ng 模版DNA,加入適量去離子水,把體積補(bǔ)足為15 μL。
            2) 于沸水中加熱10 min。
            ◆ 請記得以夾子固定微量離心管的管蓋部份,以免離心管在加熱過程中蓋子爆開、進(jìn)水!
            3) 加熱后,迅速把微量離心管移至冰浴中,靜置數(shù)分鐘。
            4) 離心數(shù)秒后,依序加入下列三種試劑:
            2 μL hexanucleotide mix
            2 μL dNTP mixture
            1 μL Klenow enzyme
            5) 以指頭輕彈離心管,以便混合均勻。
            6) 短暫離心后,置于37℃恒溫水槽中作用2 h。
            ◆ 反應(yīng)時(shí)間至少須要1 h,zui長可反應(yīng)過夜。
            7) 作用完畢的后,加入2 μL 的0.2 M EDTA,以便終止DNA 聚合反應(yīng)。
            8) 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL純酒精,混合均勻,置 -20℃過夜。
            隔天:
            1) 于13,000 rpm,4℃離心15 min。
            2) 倒出上清液,加入50 μL 的70%酒精,再離心5 min。
            3) 倒出上清液并風(fēng)干DNA。
            4) zui后以50 μL TE 溶解DNA。

            收藏該商鋪

            登錄 后再收藏

            提示

            您的留言已提交成功!我們將在第一時(shí)間回復(fù)您~

            對比框

            產(chǎn)品對比 產(chǎn)品對比 聯(lián)系電話 二維碼 在線交流

            掃一掃訪問手機(jī)商鋪
            021-61721271
            在線留言