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DNA限制酶批注討論
閱讀：922 發(fā)布時間：2011-1-18a. 限制酶： 可購自Roche Molecular Biochemicals （即以前的Boehringer Mannheim Biochemicals）, Invitrogen （即以前的Life Technologies或Gibco BRL）, New England BioLabs （BioLabs） 或其它公司。
b. 限制酶的貯存與取用： 反復(fù)解凍與凍結(jié)是任何酵素的大忌，因此不可存放于無霜冰箱中。大部份限制酶購買來時即保存在50% glycerol中，存放在 -20℃時不會凍結(jié)。 有些限制酶相當(dāng)不穩(wěn)定，必須存放在 -70℃，請避免大量購買，也請對你所用的各種限制酶的性質(zhì)作深入的了解。 自冰箱取出限制酶請立即放入 -20℃冷凍盒或冰浴中，短暫離心 （4℃） 將管壁上或蓋上的酵素離心下后再取用。添加不同限制酶必須更換微量移液器頭，不可污染。請一次取出需要量，置于微量離心管中，再分別加入各反應(yīng)中；取用后請立即放回冰箱。
c. Isoschizomers： 有些不同的限制酶可以作用在相同的DNA 序列上，這些酵素互稱為isoschizomers。 例如︰SstI 與SacI；HincII 與HindII；EspI 與Bpu1102I。相關(guān)的資料均可由工具書或各廠商目錄查到。
d. 限制酶的反應(yīng)條件： 每一廠商生產(chǎn)的限制酶均附有zui適用的10 倍濃度反應(yīng)液 （10×Rx Buf），但必須注意，同一種限制酶若來自不同廠商，其Rx Buf及反應(yīng)溫度可能不同，故使用前請務(wù)必參考其說明書或廠商目錄，廠商目錄中都會表列出各種限制酶在不同Rx Buf反應(yīng)效率。 使用兩種以上的限制酶進行切割時，可依照該表選擇適當(dāng)?shù)腞x Buf，并遵循以下幾點原則：
1. 若各種限制酶所用的Rx Buf 相同，則可同時加入反應(yīng)液中，但須注意glycerol 的zui終濃度不可超過10%，有些酵素對glycerol 濃度的限制更嚴格，不可超過5%。
2. 若各種限制酶所用的Rx Buf不同，但差異僅在鹽的濃度時，可先加入需鹽濃度較低者，反應(yīng)*后直接加入NaCl, KCl, MgCl2 等調(diào)整鹽濃度，再加入第二種酵素。
3. 若各種限制酶所用的Rx Buf *不同時，則以任一種酵素作用*后，先經(jīng)drop dialysis 更換溶液或以酒精沉淀DNA 后，再以另一種酵素作用。
e. 限制酶使用量與反應(yīng)時間： 一單位的限制酶活性通常定義為，在zui適反應(yīng)溫度與條件下，能使1 μg 基質(zhì)DNA 在1 h 被切割*所需的酵素量。通?？杉尤胼^多量的酵素或把反應(yīng)時間加長，但有些酵素不穩(wěn)定，反應(yīng)時間加長并不具意義。加入的酵素量需考慮甘油的zui終濃度。以避免甘油濃度太高造成對酵素活性的抑制或改變其作用。
f. 中止反應(yīng)： 一般限制酶可以65℃加熱15 min中止反應(yīng)，但有些酵素具熱安定性，則可加入EDTA （zui終濃度為10 mM） 或以phenol處理。
g. 限制酶無法作用時：當(dāng)樣品DNA 無法被切割時，請努力回想或檢查：
1. DNA 是否含有高鹽？
2. DNA 是否含有雜質(zhì)？
3. Phenol 或酒精是否去除干凈？
4. 酵素是否貯存不當(dāng)而失去活性？
5. 酵素量或Rx Buf 是否加入過多？
6. 反應(yīng)溫度太高或太低？
7. 酵素是否無法作用methylated DNA？