化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
甲基化檢測(cè)方法（亞硫酸氫鹽修飾后測(cè)序法）
閱讀：2839 發(fā)布時(shí)間：2011-2-21
*部分 基因組DNA的提取
這一步?jīng)]有懸念，*可以購(gòu)買供細(xì)胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟，自己配試劑提取*可以。DNA比較穩(wěn)定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應(yīng)該是完整的。
此步重點(diǎn)在于DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取過(guò)程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。
使用兩者的細(xì)節(jié)：
1、蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；
2、RNA酶必須要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在購(gòu)買市售RNA酶后進(jìn)行再處理，配制成10mg/ml。否則可能的后果是不僅沒(méi)有RNA，連DNA也被消化了。兩者均于-20℃保存。
驗(yàn)證提取DNA的純度的方法有二：
1、紫外分光光度計(jì)計(jì)算OD比值；
2、1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。
第二種方法優(yōu)于*種方法，這種方法*可以明確所提基因組DNA的純度，并根據(jù)Marker的上樣量估計(jì)其濃度，以用于下一步的修飾。
第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA
如不特別指出，所用雙蒸水（ddH2O）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌。
1、將約2ugDNA于1.5mlEP管中使用ddH2O稀釋至50μl；
2、加5.5ul新鮮配制的3M NaOH；
3、42℃水浴30min；
以下步驟在水浴期間配制：
4、10mM 對(duì)苯二酚（氫醌），加30μl至上述水浴后混合液中（溶液變成淡黃色）；
5、3.6M 亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用ddH2O稀釋，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，zui終體積為5ml。這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH后會(huì)慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準(zhǔn)確為5.0。加520μl至上述水浴后溶液中；
6、EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液；
7、加200μl石蠟油，防止水分蒸發(fā)，限制氧化；
8、50℃避光水浴16h。
這一步需要注意的細(xì)節(jié)：
1、基因組DNA的量不需十分，寧多勿少，因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失，且此方法修飾zui多可至4μg；
2、所有試劑均須新鮮配制，所以配液的技術(shù)要過(guò)關(guān)，既要快，又要；
3、亞硫酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性，一定用堿將PH調(diào)制5.0，否則PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收；
4、水浴達(dá)16小時(shí)，雖可以短至8小時(shí)，但后者修飾會(huì)有不*。