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酶活性分析法檢定蛋白質(zhì)
閱讀：875 發(fā)布時(shí)間：2010-7-1表現(xiàn)出?的酶GUS可以水解其基質(zhì)衍生物pNPG，所產(chǎn)生的黃色生成物p-nitrophenol，可供活性測定 （Jefferson et al, 1986）；
儀器用具：ELISA光?計(jì) （Dynatech）；微?滴定盤 （microtiter plate, Nunc F96 Maxisorb 442404）
藥品試劑：基質(zhì)溶液 （GUS reaction buffer）：pNPG （p-nitrophenyl β-D-glucuronide, Sigma N-1627） 31.5 mg溶于Buffer A-0 100 mL終止液 （stop buffer）：2.5 M 2-amino-2-methyl propanediol （Sigma A-9754）
方法步驟：
1） 吸取20 μL 的蛋白質(zhì)樣本，小心注入微?滴定盤中，避免氣泡產(chǎn)生。
2） 每一樣品槽加入200 μL 基質(zhì)液，混合均勻；可用燒熱的接種環(huán)去除氣泡。
3） 靜置約1~2 min，顏色開始加深，然后加入30 μL 終止液。 反應(yīng)時(shí)間的長短，要以樣本中的酶活性大小?做調(diào)整。因?yàn)槲覀冎粶y定色析法各分劃的相對酶活性，因此并?加終止液。
4） 以ELISA 光?計(jì)測定波長415 nm 的吸光值。
酶活性單位的測定：
a. 以上步驟，只可測定GUS 活性的相對大小，對色析法所得到的各個(gè)分劃進(jìn)?偵測，相當(dāng)方?，但并非酶活性單位的測定方法。
b. ?要測定酶的活性單位，要使用zui適當(dāng)?shù)拿赣?，使酶在反應(yīng)一段固定的時(shí)間后，其生成物的呈色吸光?，?在光?計(jì)的可測范圍的內(nèi)；然后計(jì)算此段時(shí)間內(nèi)，每分鐘所產(chǎn)生的吸光?增加?，轉(zhuǎn)換成生成物的莫耳數(shù)，即可求得其真正的活性單位。
c. 因此酶的活性單位定義為：每分鐘所能催化生成物的 μmole 數(shù)。