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滾動式循環(huán)放大法IHC增敏方法
閱讀：726 發(fā)布時間：2010-7-9滾動式循環(huán)放大（RCA）法是一種能夠在恒溫條件下，使標記有寡核苷酸探針（與組織細胞內(nèi)的核苷酸無相關(guān)性）的抗體（特異性一抗或第二抗）與組織細胞內(nèi)的抗原結(jié)合后，在DNA聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸進行循環(huán)擴增，產(chǎn)生一條擴增的DNA序列拷貝產(chǎn)物，此時，標記在抗體上的寡核苷酸得到有效擴增（109倍），擴增后的產(chǎn)物與后續(xù)加入的標記有示蹤物的寡核苷酸進行互補雜交，在抗原—抗體周圍形成眾多帶有標記示蹤物的雜交體，zui后通過IHC方法再放大示蹤物。該方法具有很高的敏感性和特異性。首先要合成三條寡核苷酸探針（引物），然后將寡核苷酸與抗體結(jié)合，zui后進行RCA免疫組化染色。
RCA放大原理圖
左上為寡核苷酸標記的特異性抗體與組織細胞內(nèi)的特異性抗原結(jié)合；右上為DNA聚合酶作用下與放大抗體分子上結(jié)合的核苷酸；左下為用標記示蹤劑的寡核苷酸進行互補雜交；右下為用IHC方法進一步放大檢測
（一）寡核苷酸的合成與抗體連接寡核苷酸
L標記抗體用寡核苷酸
5，—AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA—3，
2。循環(huán)放大寡核苷酸
5，—PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT—3，
3．帶有標記物的互補檢測用寡核甘酸
5，—XACTGTGAAGATCGCTTATX—3，（X=生物素），或用5，—FACTCTGAAGATCGCTTATF-3，（F＝熒光素）；或用5，—HRPACTGTGAAGATCGCTTAT HRP-3，（HRP＝辣根過氧化物酶）。
（二）寡核苷酸與抗體的結(jié)合
連接用的抗體可以是特異性一抗，也可以是第二抗體或其他的連接二抗，如抗地高辛（Dig）、抗熒光素（FITC）或抗生物素（biotin）二抗。
1．抗體的脫鹽和活化
首先對抗體免疫球蛋白進行脫鹽，然后進行抗體活化。在41 nmol抗體分子中加入410mmol的GMBS[硫代—N—（4—馬來酰亞胺丁酰）硫代丁二酰亞胺，sulfo-N-（4—maleim—idobutyryloxy）sulfosuccinimide]，暗處，37℃，在氮氣中30 rain，移人室溫中繼續(xù)反應30min，用PD-10色譜柱（用pH7．5 PBS平衡柱子）除去多余的磺化—GMBS，將活化抗體4℃濃縮。此時每一個抗體分子中含有多個馬來酰亞胺，可以用Ellman’s試劑滴定活化抗體的量，主要測定抗體分子上的巰基?？贵w活化后與寡核苷酸連接。
2．活化抗體與寡核苷酸結(jié)合
將28．1nmol磺化GMBS活化抗體和142 nmol5硫醇寡核苷酸混合，總體積為825ul，室溫中反應2h，隨后移人4℃中反應過夜。
3．純化結(jié)合物
純化結(jié)合物一般先用陰離子交換色譜柱Q—sepharose（先用梯度鹽洗柱，然后加樣，洗脫，收集結(jié)合物），再用SephadexG-200色譜柱除去游離的寡核苷酸。純化后結(jié)合物中寡核苷酸和抗體之比為10：1，多數(shù)情況下，1個抗體分子可結(jié)合3～5個寡核苷酸。
（三）RCA免疫組化染色
（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復后，PBS洗3×3min。
（2）滴加特異性一抗，37℃孵育1h，PBS洗3×3min。
（3）滴加適當稀釋的寡核苷酸標記二抗IgG 200nmol/L（用100mmol/L谷氨酸鉀—PBS稀釋），37℃孵育30min，PBS洗3×3cm，用100mmol/L谷氨酸鉀洗。
（4）循環(huán)寡核苷酸（170mmol/L），用φ29緩沖液稀釋[緩沖液內(nèi)含250mmol/L（pH7．5）Tris—HCl，50mmol/L MgCl2，lmg/ml BSA，lmmol/L dATP，lmmol/L dCTP，lmmol/LdGTP，0．75 mmol/LdTTP，0．25mol/LFITC—12—dUTP]，40ul/每片，37℃孵育30min，不洗，每張切片加入1ulφ29 DNA聚合酶（0．4U/ul），37℃繼續(xù)反應30min，PBS洗3×3mino．
（5）免抗FITC-AKP結(jié)合物1：1000稀釋，37℃30min；PBS洗3× 3min；0．02mol/LTris—HCl（pH9．0內(nèi)含氯化鎂、左旋咪唑）洗20min。
（6）NBT/BCIP顯色30～240min，核固紅襯染。
（7）常規(guī)樹膠封片，結(jié)果觀察。