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具有疏水性核心的突變體的噬菌粒文庫(kù)的鑒定
閱讀:691 發(fā)布時(shí)間:2010-8-6使用與其他噬菌體展示方法相同的步驟來(lái)對(duì)制備出的文庫(kù)的文庫(kù)容量和多樣性進(jìn)行鑒定。為了在篩選后得到序列與結(jié)構(gòu)的關(guān)系,應(yīng)保證在噬菌粒文庫(kù)中存在合理水平的過(guò)量,以確保在篩選步驟中所有克隆都能被取樣,這一點(diǎn)是很重要的。我們通常力爭(zhēng)讓文庫(kù)容量比理論上的蛋白序列多樣性過(guò)量約100倍??梢酝ㄟ^(guò)將梯度稀釋的電轉(zhuǎn)后細(xì)胞鋪板,來(lái)評(píng)估噬菌粒文庫(kù)的容量。隨后,為了測(cè)定轉(zhuǎn)化后文庫(kù)的存在,可以通過(guò)菌落PCR或者限制性酶切(如果在突變時(shí)引入或刪除了限制性酶切位點(diǎn))來(lái)鑒定單克隆。例如,如果親代克?。0澹┯幸粋€(gè)*的限制性酶切位點(diǎn)在突變時(shí)被破壞了,則可以用這一點(diǎn)來(lái)測(cè)定親代克隆在文庫(kù)中的比例。對(duì)于像從文庫(kù)那樣含有幾個(gè)部分隨機(jī)化位點(diǎn)的特定文庫(kù),通過(guò)對(duì)單克隆的DNA進(jìn)行測(cè)序來(lái)評(píng)價(jià)多樣性。序列分析會(huì)揭示在原始文庫(kù)里是否存在著對(duì)一些特殊的克隆的傾向。為了以確保沒有一個(gè)遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量于其他克隆的克隆存在,可以使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法測(cè)定需要進(jìn)行測(cè)序的克隆的zui小數(shù)量,以得到一個(gè)明確的文庫(kù)容量。