WB常見問題
常見問題 | 解決對策及注意事項(xiàng) |
兩快玻璃板之間灌膠,膠總是不平 | 玻璃沒有洗干凈，應(yīng)該要洗得非常干凈 |
過硫酸銨和TEMED的加量不合適，加量相對較多，凝膠凝固過快，也會造成膠不平現(xiàn)象 | |
加完試劑以后沒有很好的搖勻，導(dǎo)致有些部位的聚合劑濃度過高，聚合相對較快造成膠不平 | |
膠總是漏 | 避免玻璃邊緣（與膠條接觸處）破損 |
膠條一定要干，跑完電泳后，膠條就放在實(shí)驗(yàn)臺上晾著。下面的膠條注意不要老化，如果有裂紋的話用保鮮膜墊在上面，也可以有效防止漏膠 | |
將兩塊玻板擺放*對齊，底部處于同一個平面 | |
膜上有明顯氣泡 | 操作時將氣泡*排除 |
靠膜一側(cè)的濾紙應(yīng)鋪平 | |
特異性低 | 優(yōu)化一抗 |
提高一抗和二抗的稀釋度 | |
降低SDS-PAGE中蛋白的上樣量 | |
背景高 | 優(yōu)化封閉液 |
優(yōu)化洗滌緩沖液，增加洗滌次數(shù) | |
減少曝光時間 | |
較低的信號 | 優(yōu)化一抗 |
濃縮樣品 | |
選擇更高敏感度的發(fā)光底物 | |
條帶跑得比正常的窄 | 可能因?yàn)槟z凝的不均勻，聚合的不是很好，灌膠的時候盡量混勻 |
可能是樣品的問題，如果鹽濃度較高，便會擠壓其它條帶，致使條帶寬窄不一，由于同樣的原因，樣品在凝膠中的速度會很慢，造成條帶走的較慢 | |
可能是系統(tǒng)的ph出了問題，有可能是電極緩沖液，也有可能是凝膠緩沖液，更新緩沖液。 | |
條帶呈“微笑”和“倒微笑”效果 | "微笑"是因?yàn)楣嗄z的時候冷卻不均勻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。 |
“倒微笑“現(xiàn)象常常是由于垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)凝膠和玻璃板組成的三明治底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不*便會產(chǎn)生這種現(xiàn)象 | |
凝膠腫脹或卷曲 | 注意轉(zhuǎn)膜之前，切割下來的凝膠一定要在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡平衡5-10分鐘，要含有20%的甲醇。 |
WB注意事項(xiàng)
1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。
2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。
3）因?yàn)镈EPF膜的疏水性，膜必須先在甲醇中*浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外）。
4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。
5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5 小時，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。
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