目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>三羧酸循環(huán)系列>> BC2165-100T/48S線粒體異檸檬酸脫氫酶活性檢測試劑盒 三羧酸
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC1935 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 測定意義：幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏 |
線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC2165
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體600 μL×2支 | -20℃保存 |
提取液三 | 液體40 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 2-8℃保存 | |
試劑二 | 液體5mL×1瓶 | |
試劑三 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體5 mL×1瓶 | 常溫保存 |
試劑五 | 液體15 mL×1瓶 | 常溫保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 提取液二：易揮發(fā)試劑，用完后蓋緊蓋兒后及時放回-20℃保存；
2、 試劑三：臨用前加入0.375 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；
3、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg α-酮戊二酸。臨用前加入684 μL蒸餾水，配成100 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃保存8周；
4、 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量將試劑一、試劑二按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。
產(chǎn)品說明：
線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，與線粒體基因表達(dá)及線粒體其他的功能有關(guān)。異檸檬酸脫氫酶在生物體內(nèi)有兩種存在形式，以NAD為輔酶的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶，和以NADP為輔酶的NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶。
異檸檬酸脫氫酶的主要功能，是在體內(nèi)三羧酸循環(huán)中，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，將NAD還原成NADH，通過測定α-酮戊二酸的生成量，可以計算出線粒體異檸檬酸脫氫酶活力高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
低溫離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1. 稱取約0.2 g組織或收集1000萬細(xì)胞，加入1mL提取液一和10μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2. 4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。
3. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的異檸檬酸脫氫酶（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。
4. 在沉淀中加入400μL提取液三和4μL提取液二，超聲波破碎（功率300w，超聲5秒，間隔9秒，4min），4℃，10000g離心10min，取上清液用于線粒體異檸檬酸脫氫酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。
二、測定步驟
1、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至505nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將標(biāo)準(zhǔn)品用提取液三稀釋至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3、 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋表
序號 | 稀釋前濃度（µmol/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)液體積（µL） | 提取液三體積（µL） | 稀釋后濃度（µmol/mL） |
1 | 100 | 60 | 940 | 6 |
2 | 6 | 50 | 450 | 0.6 |
3 | 0.6 | 200 | 200 | 0.3 |
4 | 0.3 | 200 | 200 | 0.15 |
5 | 0.15 | 200 | 200 | 0.075 |
6 | 0.075 | 200 | 200 | 0.0375 |
7 | 0.0375 | 200 | 200 | 0.01875 |
實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、 操作表（在0.6 mLEP管/96孔板中進(jìn)行如下操作）：
試劑名稱（μL） | 對照管 | 測定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 空白管 |
上清液 | 40 | 40 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | - | - | 40 | - |
工作液 | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑三 | - | 4 | 4 | 4 |
蒸餾水 | 4 | - | - | 40 |
充分混勻， 置于37℃水浴鍋/37℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h | ||||
試劑四 | 20 | 20 | 20 | 20 |
充分混勻， 置于37℃水浴鍋/37℃恒溫培養(yǎng)箱中10 min | ||||
試劑五 | 96 | 96 | 96 | 96 |
充分混勻，室溫靜置5min，盡快測定505nm波長處的吸光值，分別記為A測定管、A對照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管，計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。（空白管只需測定1~2次） | ||||
三、ICDHm活性計算
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x(μmol/mL)。
2、酶活力計算
酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。
ICDHm酶活力（U/mg prot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×103=x÷Cpr×16.67
V上清：加入上清液體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL；T：反應(yīng)時間，1h=60min；103：單位換算系數(shù)，1μmol =103nmol。
注意事項：
1、 為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個樣做預(yù)實驗，如果測定的吸光值過高（高于1），可用提取液三稀釋上清液后再測定。計算結(jié)果時注意乘以稀釋倍數(shù)。
2、 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質(zhì)量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
3、 測定蛋白濃度時，由于試劑一本身含有蛋白（約1mg/mL），所以測定時需扣除此部分蛋白。
4、 附：使用樣本重量計算公式
A、上清（胞漿）中ICDHm活力計算：
酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×103=16.83×x÷W
V提?。杭尤胩崛∫后w積，1.01mL；V樣：加入上清液體積，0.04mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1h=60min；103：單位換算系數(shù)，1μmol =103nmol。
B、沉淀（線粒體）中ICDHm活力計算：
酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。
ICDHm活性（U/g 質(zhì)量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×103=6.73×x÷W
V提?。撼恋碇貞視r加入提取液體積，0.404mL；V樣：加入上清液體積，0.04mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，1h=60min；103：單位換算系數(shù)，1μmol =103nmol。
C、樣本ICDHm總活力計算：
樣本ICDHm總活力即為上清（胞漿）中ICDHm活力與沉淀（線粒體）中ICDHm活力之和。
按樣本質(zhì)量計算：ICDHm（U/g 質(zhì)量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W
實驗實例：
1、 取0.2g小鼠腎臟加入1.5 mL提取液一和15 μL提取液二，用冰浴勻漿器勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液，分別按操作步驟檢測，用96孔板測得：胞漿ΔA測定=A測定管-A對照管=0.25-0.25=0，線粒體ΔA測定=A測定管-A對照管=0.433-0.279=0.154，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5533x+0.0319計算x值，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
胞漿中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=16.83×x÷W=0 U/g質(zhì)量
線粒體中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=6.73×x÷W=7.43 U/g質(zhì)量
樣本總ICDHm（U/g 質(zhì)量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W=7.43 U/g質(zhì)量。
2、 取0.3g黑麥草加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴勻漿器勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，上清液稀釋2倍，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液稀釋2倍，分別按操作步驟檢測，用96孔板測得：胞漿ΔA測定=A測定管-A對照管=0.377-0.34=0.037，線粒體ΔA測定=A測定管-A對照管=0.711-0.649=0.062，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.5533x+0.0319計算x值，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
胞漿中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=16.83×x÷W×2=1.55 U/g質(zhì)量
線粒體中ICDHm活性（U/g質(zhì)量）=6.73×x÷W×2=3.66U/g質(zhì)量
樣本總ICDHm（U/g 質(zhì)量）=16.83×x÷W×2+9.16×x÷W×2=5.21 U/g質(zhì)量。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：
[1] Xiao Li,Qi Zhao,Jianni Qi,et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the
PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018;(IF3.571)
參考文獻(xiàn)：
[1] Igamberdiev A U, Gardestr?m P. Regulation of NAD-and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases by reduction levels of pyridine nucleotides in mitochondria and cytosol of pea leaves[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2003, 1606(1-3): 117-125.
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC0710/BC0715 α-酮戊二酸脫氫酶（α-KGDH）活性檢測試劑盒
BC0950/BC0955 琥珀酸脫氫酶（SDH）活性檢測試劑盒
BC0380/BC0385 丙 酮酸脫氫酶（PDH）活性檢測試劑盒
線粒體異檸檬酸脫氫酶活性檢測試劑盒 三羧酸 線粒體異檸檬酸脫氫酶活性檢測試劑盒 三羧酸
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