目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC4345-100T/48S亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC4345 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 環(huán)保,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 亞鐵氧化酶(HP)活性檢測 |
亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC4345
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體20 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、試劑三：臨用前加入6 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。
2、標(biāo)準(zhǔn)品：9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液。
產(chǎn)品說明：
亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍(lán)蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe2+）氧化為三價鐵離子（Fe3+），從而三價鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞鐵釋放。
以一定濃度的Fe2+ 為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe2+ 被氧化為Fe3+，Fe2+ 與菲咯嗪形成有色復(fù)合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計算出未被氧化的Fe2+ 的含量，進(jìn)而得出被氧化的Fe2+ 的含量，可通過Fe2+被氧化的速率來反映亞鐵氧化酶活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
1、組織：按照質(zhì)量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測。
2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至562 nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。
2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將9µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、 標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：
序號 | 稀釋前濃度（nmol/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（nmol/mL） |
1 | 9000 | 40 | 960 | 360 |
2 | 360 | 500 | 500 | 180 |
3 | 180 | 500 | 500 | 90 |
4 | 90 | 500 | 500 | 45 |
5 | 45 | 500 | 500 | 22.5 |
6 | 22.5 | 500 | 500 | 11.25 |
7 | 11.25 | 500 | 500 | 5.625 |
備注：實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
4、 操作表：在1.5 mL離心管（分光光度計）或96孔板中依次加入下列試劑：
試劑名稱 | 對照管 | 測定管 | 無基質(zhì)管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 |
蒸餾水（µL） | - | - | 8 | 8 | 8 |
樣本（µL） | 8 | 8 | - | - | - |
試劑一（µL） | 112 | 112 | 112 | 112 | 112 |
用移液槍充分吹打混勻 | |||||
試劑二（µL） | - | 40 | 40 | - | - |
標(biāo)準(zhǔn)溶液（µL） | - | - | - | - | 40 |
蒸餾水（µL） | 40 | - | - | 40 | - |
混勻，37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)3 min | |||||
試劑三（µL） | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 |
混勻，于微量玻璃比色皿/96孔板中測定562 nm處吸光值A，分別記為A對照管，A測定管、A無基質(zhì)管、A空白管和A標(biāo)準(zhǔn)管。計算ΔA測定=（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測定管-A對照管），ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個測定管需設(shè)一個對照管，同一批次無基質(zhì)管、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測1-2次。 | |||||
三、亞鐵氧化酶活性計算
1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA測定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。
2、 亞鐵氧化酶活性的計算：
（1）按照樣本蛋白濃度計算
酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N
（2）按照樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/g鮮重）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提取）÷T×N = 1.667x÷W×N
（3）按液體體積計算
酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe2+ 定義為1個酶活力單位。
亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T×N = 1.667x×N
V試劑二：加入的試劑二體積，0.04 mL；V樣：加入的樣本體積，0.008 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：3 min；N：稀釋倍數(shù)。
注意事項：
1. 當(dāng)A測定低于0.1時，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
實驗實例：
1、 取0.1g結(jié)腸，進(jìn)行樣本處理，按照測定操作步驟，測得計算ΔA測定 =（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（1.144-0.041）-（1.114-0.048）=0.037，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007，計算x=11.710，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：
亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g質(zhì)量。
2、 取兔血清，按照測定操作步驟，測得計算ΔA測定=（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測定管-A對照管）=（0.577-0.048）-（1.114-0.048）=0.574，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007，計算x=184.935，按照液體體積計算酶活得：
亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= 1.667×x=1.667×184.935=308.287 U/mL
相關(guān)系列產(chǎn)品：
BC1300/BC1305 銅藍(lán)蛋白（Cp）活性檢測試劑盒
BC1310/BC1315 總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒
BC4430/BC4435 尿酸酶活性檢測試劑盒
BC1360/BC1365 尿酸（UA）含量檢測試劑盒
BC1320/BC1325 羥自由基清除能力檢測試劑盒
亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒 微量法 亞鐵氧化酶（HP）活性檢測試劑盒 微量法
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