目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5715-100T/48S髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC5715 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | 髓過氧化物酶（MPO）活性檢測 |
髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號：BC5715
規(guī)格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 液體80 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體3 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 液體0.1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑六 | 液體1 mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1. 試劑二：臨用前取一瓶試劑二加入30mL試劑一，可37℃加熱促進溶解，2-8℃可保存2周；
2. 試劑三：低溫下試劑會出現(xiàn)析出凝固現(xiàn)象，臨用前需37℃加熱至澄清透明狀態(tài)；
3. 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑一：試劑四：試劑五=4.8mL：200μL：5μL（5mL，16S）的比例配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。
產品說明：
髓過氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）是一種由活化的中性粒細胞、單核-巨噬細胞分泌的白細胞酶，主要存在于中性粒細胞和單核-巨噬細胞的嗜苯胺藍顆粒中。當白細胞被激活后，MPO釋放到吞噬泡和血漿，在特定條件下誘導氧化應激和組織損傷，是系統(tǒng)炎癥和氧化應激的標志物。
MPO催化H2O2分解，同時將鄰聯(lián)茴香胺氧化生成有色物質，在460nm處有特征吸收峰，顏色深淺與MPO活性成線性關系。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織樣本：按質量（g）：試劑二體積（mL）=1：5~10比例加入試劑二（建議稱取0.1g樣本，加入1.0mL試劑二），冰浴勻漿后，于4℃，12000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
2. 細胞樣本：按細胞數(shù)量（106）：試劑二體積（mL）=5~10：1的比例加入試劑二（建議5×106個細胞加入1.0mL試劑二），冰浴超聲破碎細胞（功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），然后于4℃，12000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。
3. 液體樣本：按液體體積（mL）：試劑二體積（mL）=1：1的比例加入試劑二（相當于稀釋2倍），混勻，于4℃，12000g，離心10min，棄沉淀，取上清液置于冰上待測。（若測定數(shù)值較小，可以調整比例進行前處理，例如2：1或3:1）
二、 測定步驟
1．可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至460nm，分光光度計蒸餾水調零。
2．在1.5mL EP管按下表順序加樣：
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 20 | 20 |
試劑三 | 20 | 20 |
工作液 | 300 | - |
蒸餾水 | - | 300 |
混勻，37℃反應30min | ||
試劑六 | 5 | 5 |
混勻，60℃反應10min，取300μL反應液于微量玻璃比色皿/96孔板中測定460nm處各管吸光值，分別記為A測定和A對照，計算ΔA=A測定-A對照。每個測定管需設置一個對照管。 注：溫度較低時，反應液可能出現(xiàn)渾濁或凝固，此時需37℃加熱至反應液澄清透明方可進行測定。 | ||
三、MPO活性計算
1. 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白在37℃反應體系中每小時催化產生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。
MPO活性（U/mg prot）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(Cpr×V樣) ÷T= 3.053×ΔA÷Cpr
2. 按樣本質量計算
單位的定義：每g組織在37℃反應體系中每小時催化產生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。
MPO活性（U/g 質量）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(W÷V提取×V樣) ÷T = 3.053×ΔA÷W
3. 按細胞數(shù)目計算
單位的定義：每106個細胞在37℃反應體系中每小時催化產生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。
MPO活性（U/106 cell）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷(N÷V提取×V樣) ÷T = 3.053×ΔA÷N
4. 按液體體積計算
單位的定義：每mL液體在37℃反應體系中每小時催化產生1μmol氧化型鄰聯(lián)茴香胺定義為一個酶活單位。
MPO活性（U/mL）=ΔA÷(ε×d)×V反總÷V樣×F÷T=6.106×ΔA
ε：氧化型鄰聯(lián)茴香胺消光系數(shù)，11.3mL/μmol/cm；d：光徑，1cm；V反總：反應總體積，0.345mL；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V提?。航M織/細胞樣本處理時加入試劑二的體積，1mL；F：液體前處理稀釋倍數(shù)，2；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；N：細胞數(shù)目，以106計；T：酶促反應時間，30min=0.5h。
注意事項：
1. 建議每次實驗前查看試劑二和試劑三是否澄清透明，若不澄清透明，需37℃加熱至溶液澄清透明方可使用。
2. 如果?A小于0.01或測定管吸光值接近對照管，可以增加樣本量或者延長37℃酶促反應時間后再進行測定；如果?A測定大于0.5或A測定大于1.5，建議將樣本勻漿后的上清液用試劑二適當稀釋后再進行測定。注意同步修改計算公式。
實驗實例：
1. 取0.1029g小鼠肺臟樣本，加入1mL試劑二進行冰浴勻漿，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA=A測定-A對照=0.401-0.088=0.313，按樣本質量計算得：
MPO活性（U/g 質量）=3.053×ΔA÷W = 9.287 U/g 質量。
2. 取4×106個細胞KB，加入1mL試劑二進行冰浴超聲破碎，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA=A測定-A對照=0.094-0.046=0.048，按樣本細胞數(shù)目計算得：
MPO活性（U/106 cell）=3.053×ΔA÷N = 0.037 U/106 cell。
3. 取0.5mL馬血清樣本，加入0.5mL試劑二，混勻，離心后取上清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算：ΔA=A測定-A對照=0.142-0.049=0.093，按液體體積計算得：
MPO活性（U/mL）=6.106×ΔA = 0.568 U/mL。
參考文獻：
[1] Bradley PP, Priebat DA, Christensen RD. et al. Measurement of cutaneous inflammation: estimation of neutrophil content with an enzyme marker [J]. The Journal of Investigative Dermatology, 1982, 78(3): 206-209.
[2] Krawisz J E, Sharon P, Stenson W F. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity [J]. Gastroenterology, 1984, 87(6): 1344-1350.
[3] Tatjana Momi?, Zoran Vuj?i?, Vesna Vasi?. Kinetics of inhibition of peroxidase activity of myeloperoxidase by quercetin [J]. International Journal of Chemical Kinetics, 2008, 40(7): 384-394.
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