目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-微量法>>微量法生化試劑盒>> BC5355-100T/48SD-乳酸（D-LA）含量檢測試劑盒 微量法
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規(guī)格 | 100T/48S |
| 貨號 | BC5355 | 應用領域 | 環(huán)保,化工,生物產業(yè),農林牧漁,綜合 |
| 主要用途 | D-乳酸（D-LA）含量檢測 |
D-乳酸（D-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC5355
規(guī)格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液一 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
提取液二 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1支 | -20℃保存 |
試劑三 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑四 | 液體4 mL×1瓶 | |
標準品 | 液體1mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入160μL蒸餾水溶解。2-8℃可以保存4周（該試劑為凍干試劑，可能存在肉眼觀察試劑量很少的現象，此現象不影響使用）；
2、 試劑二工作液的配制：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：90μL（5T）的比例配制，現用現配，用多少配多少；
3、 試劑三：臨用前加入5mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃保存4周；
4、 標準品：1000μmol/mL D-乳酸標準液。臨用前取20μL 1000μmol/mL D-乳酸標準液和1980μL蒸餾水混合配成10μmol/mL 標準溶液；再吸取20μL 10μmol/mL 標準溶液和620μL蒸餾水混合配成0.3125μmol/mL 標準溶液備用。
產品說明：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。D-乳酸在D-乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD+還原生成NADH和H+，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應，產生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據此可計算D-乳酸含量。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、離心機、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。
操作步驟：
一、 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
2. 細胞：按照細胞數量（104個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。
3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，12000g離心10min后取上清待測。
注：提取液二需緩慢加入，加入后會產生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。
二、測定步驟
1、分光光度計/酶標儀預熱30min以上，波長調至450nm，分光光度計用蒸餾水調零。
2、加樣表：（按順序將下列試劑加在96孔板/EP管中）
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 20 | 20 | - | - |
標準品 | - | - | 20 | - |
蒸餾水 | - | 20 | - | 20 |
試劑一 | 90 | 90 | 90 | 90 |
試劑二工作液 | 20 | - | 20 | 20 |
試劑三 | 40 | 40 | 40 | 40 |
試劑四 | 30 | 30 | 30 | 30 |
充分混勻，于37℃水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱避光準確反應30min，于450nm處測定吸光值，分別記為A測定管，A對照管，A標準管，A空白管，計算ΔA測定=A測定管-A對照管；ΔA標準= A標準管-A空白管。每個測定管需設置一個對照管，空白管和標準曲線只需測定1-2次。 | ||||
三、D-乳酸含量的計算
（1）按照樣本蛋白濃度計算
D-LA含量（μmol/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（V樣本×Cpr）
= 0.3125×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
（2）按照樣本質量計算
D-LA含量（μmol/g 質量）
= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）
= 0.3711×ΔA測定÷ΔA標準÷W
（3）按照細胞數量計算
D-LA含量（μmol/106 cell）
= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）
= 0.3711×ΔA測定÷ΔA標準÷N
（4）按照液體體積計算
D-LA含量（μmol/mL）
= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]
= 4.082×ΔA測定÷ΔA標準
C標準：標準溶液濃度，0.3125μmol/mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細胞數量，以106計；V液體：液體樣本體積，0.1mL。
注意事項：
1. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。
2. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。
實驗實例：
1、 取0.104g兔肌肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.321-0.179=0.142，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.405-0.122=0.283，按樣本質量計算含量得：
D-LA含量（μmol/g 質量）= 0.3711×ΔA 測定÷ΔA標準÷W =1.7904 μmol/g質量。
2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.221-0.169=0.052，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.405-0.122=0.283，按照液體體積計算含量得：
D-LA含量（μmol/mL）= 4.082×ΔA 測定÷ΔA標準=0.75 μmol/mL。
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