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α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法

貨號(hào)：BC0715

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體110mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體1mL×1支，-20℃保存；

試劑三：液體22mL×1瓶，4℃保存；

試劑四：粉劑×1支，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存；

試劑六：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存；

試劑八：粉劑×1支，-20℃避光保存。臨用前加入0.8mL雙蒸水充分混勻待用，用不完的試劑仍-20℃保存。

工作液的配制：臨用前把試劑四、試劑五、試劑六、試劑七轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解待用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

    α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動(dòng)物、植物微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線(xiàn)粒體中，是三羧酸循環(huán)調(diào)控關(guān)鍵酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。

    α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自備的儀器和用品：

     紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、α-KGDH的提取

     稱(chēng)取約0.1g組織或收集約500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑二，冰浴用勻漿器或研缽充分研磨，4 ℃ 11000 g離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

• 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管：

取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL試劑八和12μL蒸餾水，混勻并立即測(cè)量340nm處0s的吸光值A(chǔ)1，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)2min，記錄340nm處2min時(shí)的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA空白=A2-A1。

3.測(cè)定管：

取200μL工作液加入微量石英比色皿或96孔板中，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）孵育5min后取出比色皿，再依次加入8μL試劑八和12μL樣本，混勻并立即測(cè)量340nm處0s的吸光值A(chǔ)3，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確反應(yīng)2min，記錄340nm處2min時(shí)的吸光值A(chǔ)4，計(jì)算ΔA測(cè)定=A4-A3。

三、α-KGDH活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=1473.7×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

 α-KGDH（U/g 鮮重）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=1488.5×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

α-KGDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500)÷T=2.977×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.012 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T=2456.2×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

α-KGDH活性（U/g 鮮重）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×W)÷T=2480.7×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個(gè)酶活性單位。

α-KGDH活性（U/10⁴ cell）＝[(ΔA測(cè)定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反總×10⁹]÷(V樣÷V樣總×500) ÷T=4.962×(ΔA測(cè)定-ΔA空白)

V反總：反應(yīng)體系總體積，2.2×10^-4L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；V樣：加入樣本體積，0.012 mL；V樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

• 測(cè)定過(guò)程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。
• 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
• 兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
• 測(cè)定管的ΔA值在0.01-0.25之間，若測(cè)定管的ΔA值大于0.25，需將樣本進(jìn)行稀釋。

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α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法訂購(gòu)說(shuō)明：

1、絕大部分產(chǎn)品備有現(xiàn)貨，一般情況下都能訂貨當(dāng)日發(fā)貨。 
2、部分非常用產(chǎn)品，需提前1－2日預(yù)訂，海外期貨則需要提前3-6周預(yù)訂。 
3、部分產(chǎn)品價(jià)格會(huì)因貨期、批次等因素發(fā)生變化，若有變動(dòng)以訂貨當(dāng)日新價(jià)格為準(zhǔn)。 
4、每日訂單截止時(shí)間為16點(diǎn)整，部分城市可到17點(diǎn)整，因超過(guò)截止時(shí)間造成當(dāng)日不能發(fā)貨的將于次日安排發(fā)貨。
5、請(qǐng)辦理完貨款后，將底單等連同收貨人的地址、姓名、等以傳真、、短信、等形式通知我們。

α-酮戊二酸脫氫酶活性檢測(cè)試劑盒 微量法

運(yùn)輸說(shuō)明：

極低溫產(chǎn)品：極低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中加裝干冰運(yùn)輸。用干冰把產(chǎn)品包裹起來(lái)，再用泡沫盒密封，膠帶層層粘住泡沫盒，放入索萊寶的箱子，然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶(hù)的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
低溫產(chǎn)品：低溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中加裝索萊寶冰袋運(yùn)輸。事先用冰袋把產(chǎn)品包裹起來(lái)，再使用泡沫盒密封，用膠帶嚴(yán)實(shí)密封泡沫盒，再放入索萊寶的箱子（保溫效果少可以持續(xù)一周），然后交付給合作快遞，安全快速高效放心的送客戶(hù)的手中，保證產(chǎn)品的性質(zhì)穩(wěn)定如一，為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航。
常溫產(chǎn)品：常溫產(chǎn)品運(yùn)輸過(guò)程中無(wú)需加冰或者特殊包裝。產(chǎn)品由公司庫(kù)房人員快速配貨，準(zhǔn)確快速高效的快遞保證產(chǎn)品快速送達(dá)您的手中。