神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

1 使用目的：

本試劑盒用于血清、血漿和尿樣及相關(guān)液體樣本中神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）殘留的定量檢測。

2 實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用直接競爭ELISA方法，在微孔板包被有神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）偶聯(lián)抗原，加入神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）與微孔條上預(yù)包被的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）偶聯(lián)抗原互相競爭抗神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）的含量。  

3 試劑盒組成 

3.1 預(yù)包被的神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。
3.2神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ng/ml，0.1ng/ml，,0.3 ng/ml,0.9ng/ml，,2.7 ng/ml，8.1 ng/ml。
3.3抗神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。
3.4顯色液A：1瓶（6ml）。
3.5顯色液B：1瓶（6ml）。
3.6終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
3.7樣本稀釋液：1瓶（6ml），用于樣品稀釋用。
3.8濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
3.9說明書一份。

4 需要而未提供的材料
4.1 設(shè)備
4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀。 
4.1.2粉碎機(jī)。
4.1.3量筒。
4.1.4振蕩器。
4.1.5漏斗。
4.1.6Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙。
4.1.7微量移液器。
4.2 試劑
4.2.1去離子水或蒸餾水。
4.2.2 甲醇。
5 貯存
5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍
5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6 注意事項(xiàng)
6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。
6.2 不要使用過期試劑盒。
6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。
6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有神經(jīng)節(jié)苷脂（GM），使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。
6.5 終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。
6.7 不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6.8 稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
6.9 混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。
7 工作液準(zhǔn)備
7.1神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0 ng/ml，0.1ng/ml，,0.3 ng/ml,0.9ng/ml，,2.7 ng/ml，8.1 ng/ml
7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：已備用
7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照
7.4 反應(yīng)終止液：已備用
8 樣品處理：（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

一般樣品處理

8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液
8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘
8.3用Whatman No 1濾紙過濾
8.4取100µl處理后的樣品，加入400µl樣本稀釋液
8.5取100μl稀釋液進(jìn)行分析

動(dòng)物組織前處理

8.6準(zhǔn)確稱取1±0.05 g勻漿后的組織樣品到50 ml的聚苯乙烯離心管中；加入3ml乙腈--丙酮提取溶液，2000rpm劇烈震蕩20s后4000r/min以上離心5min

8.7取上清液0.8ml在50℃氮?dú)饬飨麓蹈?/span>

8.8加入3.2mL樣品稀釋液, 750rpm渦旋20s

8.9取100ml用于分析  

飼料前處理方法

8.10準(zhǔn)確稱取1±0.05 g粉碎飼料樣品到50 ml的聚苯乙烯離心管中；加入4ml乙腈，1ml丙酮，2000rpm劇烈震蕩20s后4000r/min以上離心3min

8.11取上清液0.7ml在50℃氮?dú)饬飨麓蹈?/span>

8.12加入2.8mL樣品稀釋液,渦旋20s，混勻后取100ml用于分析

牛奶前處理方法

8.13取1 ml牛奶樣品到5 ml聚苯乙烯離心管中；加入4ml樣品稀釋液，混勻后取100ml用于分析

奶粉前處理方法

8.14準(zhǔn)確稱取0.3g奶粉樣品到7 ml的聚苯乙烯離心管中；加入2ml PBS溶液，2 ml正己烷，震蕩混勻

8.154000r/min以上離心5min，去除有機(jī)層和中間層，取下層溶液100ml到400ml 樣品稀釋液

8.16混勻后取100ml用于分析  

9 酶免分析步驟
9.1 實(shí)驗(yàn)須知
9.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。
9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
9.1.3 請不要改變分析程序
9.1.4 請使用的微量移液器
9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序
9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作
9.1.7 為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.1.8 加樣時(shí)請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
9.2 分析步驟
9.2.1 預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測
9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
9.2.3 樣品稀釋液、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）
9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
9.2.6 在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗黃曲霉素B1抗體酶結(jié)合物
9.2.8 輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。 
9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）
9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
9.4 反應(yīng)
9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A，再加 50µl顯色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之*混勻
9.4.2 37℃溫浴10min
9.4.3 每孔中加入50µl終止液，混勻
9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10 結(jié)果計(jì)算
10.1定量分析
10.1.1所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
10.1.2以神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中神經(jīng)節(jié)苷脂（GM）濃度C（ng/ml）
10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。 
10.2 半定量測定
10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

11 特異性
物質(zhì) 交叉反應(yīng)
神經(jīng)節(jié)苷脂（GM） 100%

12 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測下限為0.1 ng/ml
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
13 標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1 ng/ml ~8.1ng/ml。

14 分析限制
本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。