PKC活性檢測實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)試劑: 瓊脂糖(Promega公司，V3125) ;其他常備試劑購自sigma公司; PKC活性檢測試劑盒(Promega公司，V5330)

實(shí)驗(yàn)儀器:電泳儀(北京六一廠，112-0640) ;水平電泳槽(北京六一廠，122-3146) ;電熱恒溫培養(yǎng)箱(碧云天生物，EBI025) ;電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠，HH-8)

基本原理:分離PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白)，利用試劑盒組分將2種蛋白分離并加以區(qū)分,利用電泳瓊脂糖凝膠技術(shù)顯示2種不同的蛋白，利用分析軟件將顯示的不同蛋白定量并加以比較，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值顯示PKC活性(PKC活化度)。

操作步驟:

1.用預(yù)冷的勻漿器把細(xì)胞勻漿。

2.在4°C，用14,000 xg離心裂解液5分鐘，保存上清。

3.用PKC抽提液預(yù)平衡1ml的DEAE纖維素柱，再把第2步中得到的上清過柱。用5m的PKC抽提液洗柱子，然后用5ml含有200mM NaCI的PKC抽提液洗脫含有PKC的組分。

4.用PKC稀釋液(PKC dilution buffer)將少量蛋白激酶C (Promtein Kinase C)稀釋到2 .5ug/ml.隨試劑盒所附的產(chǎn)品信息中標(biāo)有這個酶的初始濃度。

5.用探頭超聲波破碎儀超聲處理PKC Activator Solution 20-30秒,或直到溶液變溫暖。

6.對每一個樣品，按照下面所列順序在0.5ml小離心管中混合PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,超聲過的PKC Activator 5X Solution,和水。在樣品加入之前，小離心管--直要放在冰上。陰性對照將用于對反應(yīng)進(jìn)行定量時確定其摩爾吸收值(說明書第IV部分) 。

標(biāo)準(zhǔn)PKC檢測

PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer           5ul

PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul)            5ul

PKC Activator 5X Solution,超聲處理的      5ul

短肽保護(hù)液(非必須)                    1ul

樣品                                 9ul

去離子水使終體積為                   25ul

PKC陽性對照檢測

PepTag⑧PKC Reaction 5X Buffer          5ul

PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)           5ul

PKC Activator 5XSolution,超聲處理的      5ul

短肽保護(hù)液(非必須)                   1ul

Protein Kinase C (2.5ug/ml溶于PKC dilution bufer)     4ul

去離子水使終體積為                  25ul

PKC陰性對照檢測(不加PKC)

PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer         5ul

PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)          5ul

PKC Activator 5XSolution,超聲處理的     5ul

短肽保護(hù)液(非必須)                  1ul

去離子水使終體積為               25ul

7.在0時間點(diǎn)，把--支管子從冰上移到30°C水浴中孵育2分鐘。然后加入樣品或蛋白激酶C在30°C再孵育30分鐘。

8.把管子放進(jìn)開水浴或95°C加熱塊10分鐘以終止反應(yīng)。在凝膠電泳前把樣品--直避光存放在4°C或-20°C。

9.把樣品上樣到膠上之前，往每個樣品中加進(jìn)1ul的80%甘油，以確保樣品保留在上樣孔中(說明書第II.F部分)。

10.每孔點(diǎn)樣10ul,在0. 8%瓊脂糖凝膠上以100V電泳15分鐘分開樣品，拍照。

檢測結(jié)果:

說明:后面2組泳道“陽性(PC)"和“陰性(NC)"為試劑盒自帶系統(tǒng)對照。

注:陽性條帶以Gel pro4版凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析,測其IOD (integrated optical density)累積光密度參考值。按照百分比例計(jì)算PKC活性百分比

(以陽性對照I0D值為100，其余各組的PKC+ p-PKC總和為100分配IOD數(shù)值)

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