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            廣東環(huán)凱生物科技有限公司
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            GB4789.3-2016 大腸菌群計數及注意事項

            時間:2024/4/17閱讀:1526
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            大腸菌群定義和衛(wèi)生學意義


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            大腸菌群定義:

            在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學上分類命名,它不代表某一種或某一屬的細菌,而是一組與糞便污染有關的細菌。這群細菌包括:埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬(又叫產氣桿菌屬,包括陰溝腸桿菌和產氣腸桿菌)和等。

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            衛(wèi)生學意義:

            大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的程度。

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            GB4789.3-2016 大腸菌群MPN法

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            什么是MPN法?

            MPN法是統(tǒng)計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經系列稀釋并培養(yǎng)后,根據其未生長的zui低稀釋度與生長的最高稀釋度,應用統(tǒng)計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。

            MPN值并不能表示實際菌落數,實際菌落數有可能落在置信區(qū)間內的任何一點,MPN值是落在這個置信區(qū)間內概率最大的一點。

            靈敏度較高,適用于污染菌落較少的樣品。

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            大腸菌群MPN計數的檢驗操作

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            操  作  注  意  事  項

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            建議用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液,因為磷酸鹽緩沖液能更好地糾正食品樣品中pH變化,對細菌具有保護作用。

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            初發(fā)酵接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯。

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            培養(yǎng)基檢查。加入樣品前應觀察導管內是否有氣泡,若有,應適當傾斜試管,讓氣體排出。

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            結果觀察。某些食品樣品可能會堵塞小導管底部,影響導管內氣泡的觀察,可將試管微微傾斜,用手指輕彈管壁,觀察是否有一串小氣泡沿管壁升起,若有,則判定產氣。


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            培養(yǎng)基原理解析

            月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)

            ? 月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長,胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求;氯化鈉可維持均衡的滲透壓;乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類;磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。

            ? 36±1℃培養(yǎng)24h后若已產氣,則可停止培養(yǎng)。如果沒有觀察到有產氣的現象,則繼續(xù)培養(yǎng)至48±2h。

            ? 如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯。

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            煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)

            ? 膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。

            ? 培養(yǎng)基配方當中含有膽鹽,大腸菌群發(fā)酵乳糖所產的酸會與膽鹽發(fā)生反應,形成膽酸沉淀。培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色。

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            大腸菌群最大可能數(MPN)報告

            確證的大腸菌群BGLB陽性管數,檢索MPN表,報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值

            當實驗結果在MPN表中無法查找到MPN值時,如:陽性管數為122,123,232,233等時,建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度),使樣品最高稀釋度能達到陰性終點(如果污染程度不能判定,則多加一稀釋度),然后再遵循相關的規(guī)則進行查找,最終確定MPN值。

            表B.1

            大腸菌群最可能數(MPN)檢索表

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            GB4789.3-2016大腸菌群計數平板法

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            大腸菌群平板計數法流程圖

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            操  作  注  意  事  項

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            平板法相對MPN法來說,結果更加直觀精確。長成的一個單菌落也可能來自樣品中的2~3或更多個細胞。因此平板菌落計數的結果往往偏低。適用于污染較為嚴重的樣品。

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            從一個樣品取樣到傾注瓊脂平板,應在15分鐘內完成。

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            檢驗所用物品應無菌,無抑菌殘留物。

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            BGLB確證試驗需從VRBA平板上挑起至少10個典型和可疑菌落進行,如平板上菌落數少于10個,則挑取全部典型和可疑菌落進行確證。


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            培養(yǎng)基原理解析

            結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)

            ? 配方中膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽性菌,中性紅作為指示劑,在酸性條件下為紫紅色。

            ? 大腸菌群分解乳糖所產的酸與膽鹽結合,可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環(huán)。

            ? 該培養(yǎng)基無需高溫高壓滅菌,現配現用。

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            計數典型和可疑菌落數

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            選取菌落數在15CFU~150 CFU之間的平板,分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm或更大。

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            證實試驗:

            從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,分別移種于BGLB肉湯管內,36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣,即可報告為大腸菌群陽性。

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            大腸菌群平板計數的報告

            經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:

            100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)

            若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以zui低稀釋倍數計算。

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            質量控制

            實驗室過程中,每批樣品稀釋液都要做空白對照。

            為了控制環(huán)境污染,每次檢驗過程中,于檢驗臺上打開兩塊計數瓊脂平板,并在檢驗環(huán)境中暴露不少于15分鐘,將此平板與本批次樣品同時進行培養(yǎng),以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環(huán)境的污染。

            定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應定量活菌參考品,在P2實驗室或陽性對照實驗室內,用適當的食品樣品進行陽性實驗驗證,并進行記錄,次驗證實驗至少每2個月進行1次。

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            大腸菌群測試片法

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            原理

            大腸菌群檢測片由輕便防水紙質材料做支撐,其上覆蓋干燥培養(yǎng)基層(營養(yǎng)物質、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑)和透明隔水膜組成,經輻照滅菌??捎糜谑称贰嬃系鹊拇竽c菌群計數。含有四氮唑指示劑菌落為紅色,發(fā)酵乳糖產酸和產氣。

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            培養(yǎng)基原理解析

            菌落計數特別方便(容易判讀),紅色菌落,易于食品顆粒分開,無菌落重疊現象;

            菌落分布特別均勻;

            避免了培養(yǎng)基對細菌熱損傷有關;

            菌落蔓延或半透明菌膜現象很少發(fā)生;

            經濟環(huán)保無粉塵,體積小,重量輕,易儲運;

            保質期長干制無水培養(yǎng)基,性質穩(wěn)定,保質期更長。

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            使用說明

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            所需培養(yǎng)基試劑和質控菌株

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            專注微生物監(jiān)測控制,為食藥安全保駕護航

            微生物監(jiān)測控制整體解決方案的提供者



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