單個(gè)外泌體表型分析是將免疫學(xué)與光學(xué)結(jié)合的種新技術(shù)^[1]。該技術(shù)用免疫識(shí)別將定的外泌體進(jìn)行捕獲分離，然后再對(duì)目標(biāo)外泌體的表面標(biāo)志物及內(nèi)容物（如攜帶的蛋白質(zhì)、RNA、DNA及細(xì)胞因子）進(jìn)行定量分析，從而更加全面地反映外泌體的性。借助單個(gè)外泌體表型分析技術(shù)，腫瘤學(xué)家可以更加深入的分析腫瘤相關(guān)的外泌體，以便更好的進(jìn)行腫瘤的病理生理學(xué)研究、早期篩查、診斷以及臨床治療。

       單個(gè)外泌體表型分析技術(shù)在短短兩年時(shí)間，備受廣大科研工作者的關(guān)注。本文收集了該技術(shù)在腫瘤研究域的相關(guān)應(yīng)用，以供參考。

Cell：大規(guī)模腫瘤外泌體蛋白組學(xué)研究，揭示可用于腫瘤檢測的新標(biāo)志物

       Hoshino等^[2]通過檢測腫瘤、腫瘤周邊組織以及血清的外泌體蛋白質(zhì)組，確定了來源于癌細(xì)胞的定蛋白標(biāo)記物。進(jìn)步分析癌癥病人和健康的組織和血清的外泌體蛋白質(zhì)組，得出的檢測結(jié)果的異性和準(zhǔn)確性都達(dá)到了90%以上，且通過檢測血清外泌體的內(nèi)容物可以對(duì)腫瘤種類進(jìn)行判定。

       其中，研究人員使用單個(gè)外泌體表型分析技術(shù)(Exoview)對(duì)來源于人血漿的外泌體進(jìn)行分析，成功檢測到了攜帶moesin和β2-microglobulin蛋白的外泌體（圖1），并對(duì)其進(jìn)行了定量分析。

圖1   人血漿外泌體蛋白表達(dá)分析

J   Extracell Vesicles：蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于惡性黑色素瘤外泌體亞群鑒定

       研究表明，黑色素瘤來源的外泌體可以增強(qiáng)腫瘤代謝，且其攜帶的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能用于臨床診斷。準(zhǔn)確分辨外泌體亞型有助于理解外泌體在腫瘤微環(huán)境中的作用并確定癌癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Crescitelli等^[3]為了分辨代謝性黑色素瘤來源的外泌體亞型，開發(fā)了分離外泌體的方法，并對(duì)分離的外泌體亞型進(jìn)行了分析。

       其中，研究人員將來源于黑色素瘤組織的不同離心轉(zhuǎn)速分離出來的外泌體，分為large與small兩種。對(duì)兩種外泌體，ExoView和ELISA方法都檢測到了CD9，CD63和CD81三種蛋白標(biāo)記物（圖2a&b）。而Exoview方法同時(shí)檢測出了來源于血小板的標(biāo)記物CD41a，標(biāo)志著樣本受到微量來源于血液的外泌體污染。

圖2   Exoview（a）與ELISA方法（b）檢測外泌體上的不同蛋白標(biāo)記物

J   Extracell Vesicles：表達(dá)整合蛋白的外泌體促進(jìn)癌細(xì)胞增殖

       整合蛋白是由α和β亞基組成的跨膜蛋白。50–150 nm的小外泌體（sEV）普遍含有多種整合蛋白。在腫瘤的發(fā)展過程中，整合蛋白的含量會(huì)發(fā)生變化，因此整合蛋白被認(rèn)為可能與癌癥相關(guān)。其中，αVβ3整合蛋白在人正常前列腺細(xì)胞中表達(dá)量較低，而在前列腺癌（PrCa）細(xì)胞中高表達(dá)，有研究表明，αVβ3促進(jìn)PrCa細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的粘附與侵入，但αVβ3在去勢抵抗性前列腺癌（CRPrCa，前列腺癌的種亞型）的作用仍未有詳細(xì)研究。Quaglia等^[4]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)αVβ3的CRPrCa細(xì)胞的sEV可促進(jìn)腫瘤生長和神經(jīng)內(nèi)分泌分化，而不表達(dá)αVβ3的細(xì)胞的sEV則沒有這樣的效果。

       其中，研究人員使用ExoView檢測分離出的sEV是否含有αVβ3。結(jié)果表明，對(duì)于能夠與αVβ3形成配體的蛋白標(biāo)記物（除CD41）使用相應(yīng)抗體而捕獲到的外泌體，均含有αVβ3（圖3）；而對(duì)于不與αVβ3形成配體的CD41則沒有檢測到含有αVβ3的外泌體。

圖3   檢測來源于CRPrCa細(xì)胞的含αVβ3的異性外泌體數(shù)量

Cells：CD44糖蛋白在胃癌發(fā)生中的作用

       CD44是種跨膜糖蛋白，能夠介導(dǎo)細(xì)胞間與細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用，主要配體為透明質(zhì)酸（HA）。研究表明，CD44與腫瘤的生長相關(guān)，其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且CD44與HA的結(jié)合親和力高，因此納米載體常用HA做表面修飾以作為腫瘤細(xì)胞的靶向藥物載體。外泌體是天然的靶向信息傳遞載體，有研究在外泌體中檢測到CD44。Härkönen等^[5]使用胃癌細(xì)胞MKN74研究了CD44表達(dá)對(duì)外泌體分泌，HA合成與腫瘤細(xì)胞生長的影響。結(jié)果表明，CD44促進(jìn)了細(xì)胞表面和細(xì)胞間的HA形成，調(diào)控腫瘤微環(huán)境；CD44可改變外泌體的物理性質(zhì)以及靶向性質(zhì)。

       其中，研究人員使用Exoview檢測了MKN74細(xì)胞的未經(jīng)純化的培養(yǎng)基及分離純化后的外泌體中的含CD44以及其他標(biāo)記物的含量。結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，MOCK（CD44敲除）細(xì)胞組在未經(jīng)純化的培養(yǎng)基及分離純化后的分泌外泌體的數(shù)量顯著降低。以上結(jié)果表示ExoView可以直接對(duì)復(fù)雜環(huán)境的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測，無需分離純化步驟，且檢測結(jié)果具有*異性。

圖4   ExoView檢測表達(dá)不同蛋白標(biāo)記物的外泌體數(shù)量

       在以上的研究中，ExoView系統(tǒng)以*的靈敏度和異性準(zhǔn)確地檢測了體液與培養(yǎng)基中定外泌體的含量。外泌體作為癌癥的早期診斷工具，以及應(yīng)用外泌體載藥的治療方法，今后將成為癌癥診斷與治療研究的重要方向。ExoView將在今后的研究中，給出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，助力人類終攻克癌癥。

參考文獻(xiàn)：

[1] Scherr, S. M., Daaboul, G. G., Trueb,   J., Sevenler, D., Fawcett, H., Goldberg, B., ... & U?nlu?, M. S. (2016). Real-time capture and   visualization of individual viruses in complex media. ACS nano, 10(2),   2827-2833.

[2] Hoshino, A., Kim, H. S., Bojmar, L.,   Gyan, K. E., Cioffi, M., Hernandez, J., ... & Lyden, D. (2020).   Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.   Cell, 182(4), 1044-1061.

[3] Crescitelli, R., Lässer, C., Jang, S.   C., Cvjetkovic, A., Malmhäll, C., Karimi, N., ... & Lötvall, J. (2020).   Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma   tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.   Journal of extracellular vesicles, 9(1), 1722433.

[4] Quaglia, F., Krishn, S. R., Daaboul,   G. G., Sarker, S., Pippa, R., Domingo-Domenech, J., ... & Languino, L. R.   (2020). Small extracellular vesicles modulated by αVβ3 integrin induce   neuroendocrine differentiation in recipient cancer cells. Journal of   extracellular vesicles, 9(1), 1761072.

[5] Härkönen, K., Oikari, S., Kyykallio,   H., Capra, J., Hakkola, S., Ketola, K., ... & Rilla, K. (2019). CD44s   assembles hyaluronan coat on filopodia and extracellular vesicles and induces   tumorigenicity of MKN74 gastric carcinoma cells. Cells, 8(3), 276.

全自動(dòng)外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView R100）簡介

       Nanoview基于表型分析技術(shù)研發(fā)推出的全自動(dòng)外泌體熒光檢測分析系統(tǒng)（ExoView   R100）是款無需純化的、全自動(dòng)的可對(duì)單個(gè)外泌體進(jìn)行表征分析的全新設(shè)備。該設(shè)備能夠提供外泌體表征信息，包括顆粒大小、計(jì)數(shù)、表型與生物標(biāo)志物共定位等，提供多層次和全面的外泌體測量解決方案。ExoView R100允許研究者直接分析定群體的外泌體或外囊泡。通過ExoView芯片，客戶能夠直接多分析9個(gè)不同的樣本，節(jié)省成本、時(shí)間，并減少純化所帶來的偏差。為了更好的服務(wù)您的科研工作，Quantum   Design中國也建立了樣機(jī)演示實(shí)驗(yàn)室，可以為您提供業(yè)的售前、銷售、售后技術(shù)支持。