蛋白質(zhì)免疫印跡雜交實(shí)驗(yàn)（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻譯指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成量分析檢測(cè)手段中經(jīng)典和廣泛為業(yè)界認(rèn)可的一種,也是論文中常見(jiàn)的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)形式之一。雖然Western Blot實(shí)驗(yàn)原理比較簡(jiǎn)單，但是實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣和實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差，導(dǎo)致剛進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的小伙伴們，實(shí)驗(yàn)做的焦頭爛額。
那么如何做出一手漂亮的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果呢，請(qǐng)小伙伴們跟隨星博士的腳步，了解Western Blot實(shí)驗(yàn)的相關(guān)知識(shí)，let's go！
Western Blotting實(shí)驗(yàn)步驟：
- 樣品制備
樣本制備是決定蛋白質(zhì)免疫印跡是否成功的關(guān)鍵步驟之一。樣本必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理。膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還需要注意的一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要加入PMSF抑制酶的活性。思科捷為大家提供強(qiáng)、中、弱三種RIPA裂解液，以及適用于各種類型的蛋白酶抑制劑。
- 電泳分離
準(zhǔn)備好樣品后，第二步就是上樣和電泳分離了，上樣之前小伙伴們要做的必要步驟是確定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定上樣量。星博士給大家推薦BCA和Bradford兩款蛋白濃度測(cè)定試劑盒，小伙伴們可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求自行選擇。
測(cè)完了蛋白質(zhì)濃度，接下來(lái)就是上樣了。首先要制備凝膠，選用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（EC0003），簡(jiǎn)單省時(shí)。然后安裝電泳槽，將膠片安置在電泳槽中，在電泳裝置中加入SDS-PAGE電泳液。思科捷提供10×的電泳液，稀釋后直接使用，方便快捷。
上樣結(jié)束后，設(shè)置電泳程序一般濃縮膠80V，分離膠120V，電泳時(shí)間一般為1-2小時(shí)，根據(jù)溴酚藍(lán)指示位置選擇停止電泳時(shí)間即可。
- 轉(zhuǎn)膜
針對(duì)特定分子量大小靶蛋白而選擇適當(dāng)轉(zhuǎn)膜條件（轉(zhuǎn)膜時(shí)間，轉(zhuǎn)膜緩沖液和必要低溫環(huán)境）能夠?qū)?SDS-PAGE 膠上蛋白樣品盡可能*轉(zhuǎn)移到印跡膜上，同時(shí)減少蛋白不必要的降解，這對(duì)于終獲得清晰、可信結(jié)果也是需要考慮因素。轉(zhuǎn)膜方式主要包括濕式電印跡法（轉(zhuǎn)膜方法）、半干式電印跡（可選的替代轉(zhuǎn)膜方法）以及干式電印跡（有限靈敏度的轉(zhuǎn)膜方法）。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室習(xí)慣和需求，小伙伴們可以自行選擇轉(zhuǎn)膜方式。
膜的選擇
膜的選擇主要從實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)要求來(lái)考慮，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因?yàn)榭赡軙?huì)使得蛋白因透過(guò)膜孔而造成膜結(jié)合的目的蛋白含量不確定，從而影響終結(jié)果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白選擇0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白選擇0.45um的膜。常見(jiàn)的膜有NC膜和PVDF膜，區(qū)別如下：
| NC膜 | PVDF膜 |
靈敏度和分辨率 | 高 | 高 |
背景 | 低 | 較高 |
結(jié)合能力 | 80-110ug/cm2 | 125-200ug/cm2 |
材料質(zhì)地 | 干的NC膜易脆 | 機(jī)械強(qiáng)度高 |
溶劑耐受性 | 無(wú) | 有 |
操作程序 | 緩沖液潤(rùn)濕，避免氣泡 | 使用* %甲醇潤(rùn)濕 |
檢測(cè)方式 | ECL檢測(cè) | ECL檢測(cè) |
價(jià)格 | 較便宜 | 較貴 |
轉(zhuǎn)膜方式的選擇
濕轉(zhuǎn)：
通常我們?cè)谧鰸褶D(zhuǎn)的時(shí)候，選擇100V恒壓（高強(qiáng)度，因?yàn)榈蛷?qiáng)度時(shí)間較長(zhǎng)，且效率較低），電流控制在120-350mA之間，分子量在60KD以下的60分鐘即可，分子量在60KD以上的需要延長(zhǎng)轉(zhuǎn)膜時(shí)間60-150分鐘才能確保高效率的轉(zhuǎn)膜。所以如果你所研究的兩個(gè)蛋白分子量差異比較大（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考慮將膠從中間分開(kāi)，兩部分分別采用不同時(shí)間轉(zhuǎn)印，能達(dá)到你理想的效果。電轉(zhuǎn)液一般可以重復(fù)使用3次，之后電流會(huì)過(guò)大，不適合再使用。
濕轉(zhuǎn) |
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
轉(zhuǎn)膜條件靈活容易進(jìn)行調(diào)整 | Buffer加熱可能干擾轉(zhuǎn)印 |
多種Buffer可用于優(yōu)化轉(zhuǎn)印 | 在轉(zhuǎn)印的時(shí)候需要制冷裝置 |
可以延長(zhǎng)轉(zhuǎn)印時(shí)間 | 需要大量的轉(zhuǎn)膜緩沖液 |
可用于定量Western Blot | |
半干轉(zhuǎn)：
對(duì)于半干轉(zhuǎn)來(lái)說(shuō)，也需要進(jìn)行堆疊組裝（濾紙，膠，膜需要放在轉(zhuǎn)印buffer中進(jìn)行預(yù)平衡）放在裝置電極板的底部，蓋上上極板，高強(qiáng)的電流通過(guò)三明治結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)印速度較快，一般小于1h。
半干轉(zhuǎn) |
優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
轉(zhuǎn)膜速度快 | 低分子量蛋白容易轉(zhuǎn)過(guò) |
用不連續(xù)的Buffer系統(tǒng)優(yōu)化轉(zhuǎn)印的蛋白 | 對(duì)于分子量＞120KDa的蛋白，轉(zhuǎn)印較困難 |
轉(zhuǎn)膜緩沖液用量少 | 轉(zhuǎn)膜過(guò)程容易干膠 |
容易安裝 | 對(duì)于定量的Western實(shí)驗(yàn)不推薦使用 |
對(duì)于同一蛋白的多張膜的分析比較有益 | |
需要注意的是：低溫對(duì)于膜的轉(zhuǎn)印是至關(guān)重要的，尤其是在轉(zhuǎn)印時(shí)間較長(zhǎng)而無(wú)人監(jiān)管的情況下。針對(duì)剛建的實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)或者一些新蛋白的研究，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)印的膠和膜都要通過(guò)染色確定轉(zhuǎn)膜效率（膠用考馬斯亮藍(lán)加熱染色，膜用麗春紅染色，均只需幾分鐘，并不耽誤太多時(shí)間），不然后面的實(shí)驗(yàn)既費(fèi)時(shí)也費(fèi)抗體。
