Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（膜聯(lián)蛋白A5-綠色熒光素/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測試劑盒）（胎盤抗凝蛋白-綠色熒光素/碘化丙啶細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
| Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒 （Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit） Cat number：KGA For Research Use Only Store at4℃ for one year Expire date：  一、 試劑盒說明 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。 本試劑盒可應(yīng)用于培養(yǎng)細(xì)胞凋亡檢測（不*用于檢測組織樣本）。 二、 試劑盒組份
三、試劑盒以外自備儀器和試劑 流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡、低速離心機、微量移液器 1.5m L Microtube、載玻片、蓋玻片（熒光顯微鏡觀察需用）、PBS、不含EDTA的胰酶消化液 四、 使用注意事項 1． 微量試劑取用前請離心集液。 2． Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）避光保存及使用。 3． Propidium Iodide （PI）有毒，操作時要戴手套。 4． 本試劑盒適用于檢測活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測時，細(xì)胞數(shù)量不以應(yīng)低于1×105，，不*用于檢測組織樣本。 5． *使用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。如果是貼壁細(xì)胞，需用不含EDTA的胰酶消化，如消化不當(dāng)，可能引起假陽性，而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團，而影響檢測?？蓪⒁让赶蠹?xì)胞的保存在含2%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。 6． 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。 7． 因檢測細(xì)胞的類型、凋亡誘導(dǎo)劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照，進行熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)。 五、操作方法 1． 懸浮細(xì)胞離心（2000rpm離心5min）收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）； 2． 用PBS洗滌細(xì)胞二次（2000rpm離心5min）收集1~5×105細(xì)胞； 3． 加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞； 4． 加入5μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻； 5． 室溫、避光、反應(yīng)5～15min； 6． 請在1 hour內(nèi)，進行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。 A．熒光顯微鏡觀察 1． 滴一滴上述染色后的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞； 2． 對于貼壁細(xì)胞來說，也可直接用蓋玻片來培養(yǎng)細(xì)胞并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡； （1） 將細(xì)胞于蓋玻片上生長，用適當(dāng)?shù)牡蛲稣T導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并設(shè)立陰性對照組； （2） 用PBS洗滌細(xì)胞兩次； （3） 在500μL 的Binding Buffer中加入5μL Annexin V-FITC， 5 μL Propidium Iodide，混勻； （4） 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋； （5） 避光、室溫反應(yīng)5 min。 3． 將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下、雙色濾光片（FITC和羅丹明）觀察 Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。 B． 流式細(xì)胞儀分析 用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。 Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI紅色熒光通過PI通道（FL2或FL3）檢測，建議使用FL3。 熒光補償調(diào)節(jié)：使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。 六、實驗范例 用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)P388細(xì)胞凋亡，在37oC，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6h后，參照說明書的操作方法進行檢測，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果見下圖。   對照 誘導(dǎo)劑處理 |
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