邱模昌，蔡靈卿，王 芳，劉建明，程暢河

（江西醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，江西  上饒３３４０００）

摘要：目的     研究β－胡蘿卜素（β－Ｃ）對高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，并初步探討其作用機制。方法     在血管內(nèi)皮細胞長至８０％ 以上融合時，將其分為５組：正常對照組、高糖損傷組及低、中和高劑量β－Ｃ 組，每組６ 個復孔。正常對照組加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，高糖損傷組加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ，低、

中和高劑量β－Ｃ 組分別加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１ ＋１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 。各組放置５％ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４８ｈ后，收集細胞或培養(yǎng)液進行實驗。使用酶聯(lián)免疫檢測儀、采用  ＭＴＴ 比色法檢測５ 組血管內(nèi)皮細

胞存活率，采用流式細胞儀檢測血管內(nèi)皮細胞凋亡率、血管內(nèi)皮細胞中活性氧（ＲＯＳ）水平，使用全自動生化儀、采用乳酸→丙酮酸連續(xù)監(jiān)測法檢測５組血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（ＬＤＨ）活性，使用全自動生化儀、采用硫代巴比妥酸比色定量法檢測５組血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中丙二醛（ＭＤＡ）的水平；先參照   ＮＯ 檢測試劑盒的使用說明書進行實驗，后采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測５組血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中 ＮＯ 水平。結(jié)果 與正常對照組比較，高糖損傷組的血管內(nèi)皮細胞存活率、血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中 ＮＯ 水平均明顯降低，血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中 ＬＤＨ 活性、

ＭＤＡ 水平，血管內(nèi)皮細胞凋亡率、血管內(nèi)皮細胞中 ＲＯＳ水平均明顯升高（均 Ｐ＜０．０１）；與高糖損傷組比較，中、高劑量β－Ｃ 組的血管內(nèi)皮細胞存活率、血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中 ＮＯ 水平均明顯升高，血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中 ＬＤＨ 活性、ＭＤＡ 水平及低、中和高劑量β－Ｃ 組的血管內(nèi)皮細胞凋亡率、血管內(nèi)皮細胞中 ＲＯＳ水平均明顯降低（Ｐ＜０．０５或

Ｐ＜０．０１）。結(jié)論    β－胡蘿卜素對高糖誘導的臍靜脈內(nèi)皮細胞的損傷具有保護作用，其機制可能與增加 ＮＯ 水平和

促進 ＲＯＳ的降解有關(guān)。

關(guān)鍵詞：糖尿病；β－胡蘿卜素；高糖；血管內(nèi)皮細胞損傷；活性氧；臍靜脈；保護作用

中圖分類號：Ｒ９６；Ｒ５８７．１      文獻標志碼：Ａ       文章編號：２０９５－４７２７（２０１４）０７－００２４－０５

β－胡蘿卜素（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ，β－Ｃ）是常見類胡蘿卜素之一，類胡蘿卜素呈現(xiàn)很強的抗氧化性，具有清除

自由基、保護血管、抗腫瘤、護膚、增強免疫功能及保護神經(jīng)系統(tǒng)等作用。有研究［７］發(fā)現(xiàn)，β－Ｃ 能充分提

高 ＮＯ 的水平和生物利用度，舒張血管，保護血管，

同時β－Ｃ 還能抑制 ＲＯＳ水平的升高，保持機體抗氧化能力和不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間的動態(tài)平衡，預防動脈粥樣硬化等的發(fā)生，但β－Ｃ 對高糖

誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的保護效應目前研究較

少。本研究觀察了β－Ｃ 對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護效應，并從 ＲＯＳ與 ＮＯ 途徑探討β－Ｃ 對血管內(nèi)皮細胞損傷的保護效應機制。

１ 材料與方法

１．１  實驗材料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 購自中南大學（源自 ＡＴＣＣ 細胞庫），ＤＭＥＭ 培養(yǎng)基（上海恒遠生物科技有限公司），ＭＴＴ 溶液、Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、

ＬＤＭＳＯ、乳 酸 脫 氫 酶 （ＬＤＨ ）試 劑 盒 和 丙 二 醛

（ＭＤＡ）試劑盒（海門市碧云天生物技術(shù)研究所），

沙長錦應用技術(shù)研究所），６５２ 酶聯(lián)免疫檢測儀（美國ＢＩＯ－ＲＡＤ 公司），ＤＸＣ６００全自動生化分析儀（美國 Ｂｅｃｋｍａｎ 公司），ＦＡＣＳＣ－ＡＬＩＢＵＲ 流式細胞儀

（美國ＢＤ 公司）。

１．２  實驗方法

１．２．１  血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)與實驗分組、加藥方法

１）將人臍靜脈內(nèi)皮細胞株 ＨＵＶＥＣ－１９ 傳代至第３代后用２０％ＤＭＥＭ（含１０％ 胎牛血清）懸浮細胞，計數(shù)后以５×１０３／孔的細胞數(shù)接種于六孔板培養(yǎng)板中，待 細胞長至 ８０％ 以上融合時進行實驗。

２）在血管內(nèi)皮細胞長至８０％ 以上融合時，將其分為

５組：正常對照組、高糖損傷組及低、中和高劑量β－Ｃ 組，每組６個復孔。正常對照組加入１０％ 葡萄糖注射液５．５ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，高糖損傷組加入１０％ 葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，低、中和高劑量β－Ｃ 組分別加入β－Ｃ１０、２０、４０μｍｏｌ·Ｌ－１＋１０％葡萄糖注射液３３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１。各組放置５％ＣＯ２  培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４８ｈ后，收集細胞或培養(yǎng)液進行實驗。３）將傳代至第３代的血管內(nèi)皮細胞分為５組：正常對照組、高糖損傷組及低、中和高劑量β－Ｃ 組。

１．２．２  血管內(nèi)皮細胞存活率的檢測

將５ 組 （傳 代至第 ３ 代的血管內(nèi)皮細胞）用２０％ＤＭＥＭ（含１０％胎牛血清）懸浮細胞后，以每孔１０３  的 細 胞 數(shù) 接 種 于 ９６ 孔 板 培 養(yǎng) 板 中，每 孔２００μＬ，每組接種６ 個復孔。待細胞貼壁后８ｈ 后加藥，正常 對照組、高 糖損傷組及低、中 和高劑量β－Ｃ組加藥同１．２．１ 段。加藥后，放置５％ＣＯ２ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ｈ。培養(yǎng)２４ｈ后，每孔加入 ＭＴＴ 溶液（５ｇ·Ｌ－１ ）１５μＬ，再放置 ５％ＣＯ２  培養(yǎng)箱中培養(yǎng)４ｈ。培養(yǎng)４ｈ后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。

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