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恒遠(yuǎn)總結(jié)：細(xì)胞活性的三種測定方法
閱讀：2896 發(fā)布時(shí)間：2011-11-30
細(xì)胞活性測定方法
細(xì)胞活性測定方法有臺盼藍(lán)染色法、克?。洌┬纬煞?、3H放射性同位素?fù)饺敕ā?MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，由于在去上清操作時(shí)會(huì)有可能帶走小部分的Formazan，故有時(shí)重復(fù)性略差。為了解決這個(gè)問題，研究人員又開發(fā)了很 多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。
現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個(gè)簡單介紹：
1.MTT法
MTT：化學(xué)名： 3-（4，5-二甲基噻唑，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲 ，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲 的有機(jī)溶劑對 實(shí)驗(yàn)者也有損害。-2）-2
現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個(gè)簡單介紹：
1.MTT法
MTT：化學(xué)名： 3-（4，5-二甲基噻唑，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲 ，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲 的有機(jī)溶劑對 實(shí)驗(yàn)者也有損害。-2）-2
2.XTT法
XTT：化學(xué)名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。
缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。
XTT：化學(xué)名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。
缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.CCK-8法或稱WST-8法
CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 （Formazan）。的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT；5、對細(xì)胞毒性?。?、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。
缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加。
CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 （Formazan）。的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT；5、對細(xì)胞毒性?。?、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。
缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加。
三種方法的比較
| | MTT法 | XTT法 | CCK-8法（WST-8法） |
| 甲臜物水溶性 | 難溶性 | 水溶性 | 水溶性 |
| 檢測波長 | 490 nm | 450nm | 450nm |
| 性狀 | 粉末 | 2瓶溶液 | 1瓶溶液 |
| 使用方法 | 配成溶液后使用 | 現(xiàn)配現(xiàn)用 | 毋需預(yù)制 |
| 使用有機(jī)溶劑 | DMSO或其它溶劑 | — | — |
| 方便性 | + | ++ | +++ |
| 檢測速度 | + | ++ | +++ |
| 重復(fù)性 | + | ++ | ++ |
| 穩(wěn)定性 | ++ | + | ++ |
| 工作量 | --- | -- | - |
| 對細(xì)胞毒性 | --- | -- | - |
| 對人體毒性 | --- | - | - |
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