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恒遠告訴大家：WB實驗的常見問題答疑（2）
閱讀：1702 發(fā)布時間：2012-8-7上海恒遠生物科技有限公司是一家生物技術企業(yè)，主要從事免疫學、分子生物學和常規(guī)生化試劑的研發(fā)、銷售。并代理銷售Omega、Sigma、R&D、ATCC、HYCLONE等二十多家國外，致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供*的科研試劑和完善的技術服務，滿足生物化學、分子生物學、細胞生物學、免疫學等生物科技實驗需求。
11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？
答：a）抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b）蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等
12、蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉上去了，為什么？
答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉移時間不夠，。
答：可能是：a）樣品濃度過低；b）轉移時間不夠，。
13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：①免疫組化可以用來進行定位，但是不能定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。
②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了
17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，加20％甲醇
答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。
14、要驗證某個細胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
答：①免疫組化可以用來進行定位，但是不能定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。
②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？
答：懷疑是樣品問題，可能是：1，樣品不能反復凍融；2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程，提高一抗?jié)舛?。對于加蛋白酶抑制劑來說，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
16、細胞水平要做western blot，多少細胞提的蛋白夠做western blot？
答：一般5×10^6就足夠了
17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？
答：能，沒有問題。
18、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的Western Blot檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。
19、如果目標蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？
答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉膜時經常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉到了膜上，就是在轉膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？
答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉移時你可以用減少電流延長時間，加20％甲醇
上海恒遠生物科技有限公司提供試劑盒代測以及實驗室外包服務，如果你想了解更多關于western blot實驗的詳細信息，來函！