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上海源葉生物科技有限公司
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裂谷熱診斷技術(shù)--ELISA方法
2011-6-15 閱讀(484)
直到2000年，裂谷熱只限定在非洲流行，但是zui近在阿拉伯半島致死性的暴發(fā)，表明需要快速診斷、有效地處理和預(yù)防這一疾病。
該病由于沒有特征性的臨床癥狀，因此個別病例的診斷較為困難，但是該病具有以下流行特征：眾多動物流產(chǎn)，新生畜大批死亡，乃至人群發(fā)病。RVFV通常流行于非洲國家，流行常伴隨著特大降雨的周期循環(huán)，較少發(fā)生在半干旱地區(qū)（30—35年的周期），或者較頻繁（3～10年的周期）發(fā)生在較大雨量的草原地區(qū)。
經(jīng)典的檢測裂谷熱病毒抗體的參考方法是建立在多種形式的病毒中和試驗（VN）和血凝抑制試驗基礎(chǔ)上的，包括微量中和試驗，蝕斑減少中和試驗（PRN），小白鼠中和試驗等，主要用來檢測不同動物血清中的病毒特異性抗體，因只能用活病毒進行試驗，不適合疫區(qū)外使用。盡管它們具有較高的靈敏度和特異性，但是價格昂貴且耗時，那些方法的一個很大的不利之處是對試驗人員具有健康風險，并且限制了它們在非疫區(qū)國家的使用。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、血凝抑制（H1）、瓊脂凝膠免疫擴散試驗（AGID）、免疫熒光試驗和補體結(jié)合試驗等，均可用于檢測病毒，但這些試驗的結(jié)果與白蛉熱病毒屬的其他血清型有交叉性，這些試驗可用滅活抗原進行，可用于無裂谷熱的國家。
ELISA具有較高的可靠性和靈敏度，可利用幾種抗原檢測RVFV特異性抗體，OIE參考實驗室建立了間接ELISA，以滅活的細胞培養(yǎng)物作為抗原，使用G蛋白—辣根過氧化物酶結(jié)合物，該試驗較為靈敏，可于數(shù)小時檢測出RVFV抗體；用于ELISA檢測的抗原、標準血清和操作程序均可以從參考實驗室獲得。
OIE診斷手冊上的試驗程序如下（除非其他說明，使用的體積均為50ul／孔，所有的稀釋液用3g／100ml脫脂奶緩沖液，并且所有的洗滌進行3次）。
①以預(yù)先確定的濃度分別用陽性抗原和陰性抗原包被半塊板，每孔 50ul。4℃孵育過夜。洗板。
②每孔加入100~L封閉液，37℃孵育1h。洗板。
③將待檢血清和對照血清以預(yù)先確定的濃度分別加入到陽性和陰性抗原孔中，每份兩個重復(fù)。37℃孵育1h。洗板。
④加人工作濃度的G蛋白—辣根過氧化物酶結(jié)合物。37℃孵育1h。洗板。
⑤加入提供的四甲聯(lián)苯胺底物，然后將板室溫（22℃）避光保存20min（顯色時間）。
⑥加入終止液（2mol／L硫酸），然后在450nm／650nm的光密度下讀板。
Paweska等建立了間接ELISA、IgG夾心ELISA和IgM捕獲ELISA檢測裂谷熱抗體，以適應(yīng)當前日益增長的與臨床診斷、風險評估和風險因子研究相關(guān)的診斷靈敏性和特異性的可靠評估。與病毒中和試驗和血凝抑制試驗相比，IgG夾心ELISA在檢測裂谷熱病毒早期感染或免疫zui早的免疫球蛋白反應(yīng)時更加靈敏。從田間取得的數(shù)據(jù)表明，它的靈敏性和特異性在不同反芻動物中分別固定在99．5％～100％和99．1％～99．9％之間。IgG捕獲ELISA的特異度在不同動物種類中從97．4％一99．4％之間變化；它的靈敏度在綿羊感染后的5—42天是100％。
當然，這一疾病的診斷應(yīng)當包括多種程序，如病毒在細胞培養(yǎng)中的分離，抗原的ELISA試驗，確實的PCR方法，或者通過免疫吸附試驗或者免疫熒光試驗來檢測病毒特異性IgG和IgM，同時這些診斷技術(shù)還應(yīng)當與臨床癥狀、病理變化、流行病學調(diào)查等相結(jié)合。
