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上海源葉生物科技有限公司
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核酸雜交技術(shù)
2011-7-23 閱讀(1001)
核酸雜交技術(shù)是較早的應(yīng)用于病原微生物的檢測技術(shù)。因其操作步驟比較煩瑣，現(xiàn)在在動物檢驗檢疫中應(yīng)用較少，但是它是其他一些核酸檢測技術(shù)的基礎(chǔ)。它的基本步驟如下。
首先，制備一段寡核苷酸，其序列對應(yīng)于被測病原微生物某段特異性核酸序列，在此寡核苷酸上進行適當(dāng)?shù)臉?biāo)記，作為檢測用探針。
然后，從樣品中提取核酸，對此核酸進行變性處理后固定在固相載體上，這些核酸變性處理后多數(shù)以單鏈的形式存在，因此它們能夠利用堿基互補原理，結(jié)合并固定探針，由于借助探針上標(biāo)記的物質(zhì)可以了解到是否有探針，甚至有多少探針被固定上去，再由此推知樣品中是否含有及甚至含有多少病原微生物。
上述是zui常用的固相雜交大致過程，除此之外還有液相雜交以及用于研究的細胞內(nèi)定位（原位）雜交模式。新近發(fā)展的核酸芯片技術(shù)實際上也是一類核酸雜交技術(shù)。
就固相雜交而言，又可分為斑點雜交和凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交。斑點雜交是直接將標(biāo)本點在固相載體上雜交，該法迅速簡單，一次可檢測大量標(biāo)本；凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交是電泳技術(shù)和雜交技術(shù)結(jié)合的一種方法，根據(jù)雜交核酸的不同，又可分為Southern印跡法（檢測DNA）及Northern印跡法（檢測RNA）。傳統(tǒng)的固相載體多應(yīng)用硝酸纖維膜和尼龍膜，近年來發(fā)展的微孔板包被技術(shù)以微孔板為載體取得了良好的效果。
探針標(biāo)記物有放射性核素與非放射性物質(zhì)兩種。放射性核素標(biāo)記敏感性高，可檢測出pg水平的核酸，但因不易長期保存，且存在放射性污染等問題，現(xiàn)已較少應(yīng)用。非放射性物質(zhì)常用的有生物素、地高辛等，非放射性探針安全、穩(wěn)定、操作方便并且經(jīng)濟，但敏感性較低，近年來，由于雜交信號檢測方法的改進，檢測的敏感性得到了很大提高。
