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2012-5-18 閱讀(2822)
一、實驗原理
體外連接的重組DNA分子導入合適的宿主細胞中才能大量的進行復制、增殖和表達。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細胞會易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導細胞進入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前實驗室常用的制備感受態(tài)細胞的方法，其原理是使細菌處于0°C 、CaCl2低滲溶液中，細胞膨脹成球形，細胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細胞膜表面，經(jīng)42°C短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收DNA復合物。宿主細胞一般是限制―修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若將轉(zhuǎn)化的細胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個克隆含有質(zhì)粒。
本實驗以E.coli JM109菌株為受體細胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細胞進行適當稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未有轉(zhuǎn)化的受體細胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及DNA測序等實驗。
二、儀器及試劑
1. 儀器：
恒溫搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、分光光度計、高速冷凍離心機、臺式離心機。
2. 材料
E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。
3. 試劑：
LB培養(yǎng)液（1L）：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g（高鹽）或5g（低鹽）
氨芐青霉素（Ampicillin） 100mg/ml
在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55℃，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4℃?zhèn)溆谩?br />
LB平板培養(yǎng)基：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
NaCl 10g或5g ，
瓊脂 13g
在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至50℃，取出培養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需30～50ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)基*凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4℃?zhèn)溆谩?br />
其它試劑： 0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水
三、操作步驟
1. 感受態(tài)細菌的制備：
（1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，接種于裝有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中中，37℃ 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（12～16h）。
（2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培養(yǎng)基三角瓶中中，37℃，220 rpm振蕩培養(yǎng)2－3h，隔20－30min測量OD600值，至OD600值為0.3-0.4。無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。
（3） 4℃，12000 rpm，離心2 min，以回收細菌。
（4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。每管加1ml冰預冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴30 min 。
（5）4℃，12000 rpm，2 min。
（6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加100 ul冰預冷的0.1 mol/L CaCl2重新懸浮細胞（重懸時操作要輕），即成感受態(tài)細胞懸浮液。
2.細菌轉(zhuǎn)化：
（1）取3只滅菌的Ep管，分別編號1、2、3、分別加入以下各組分：加入10～20ng質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時做兩個對照組：
1號：受體菌對照組： 100ul感受態(tài)細胞懸浮液+2ul無菌ddH2O
2號：質(zhì)粒DNA對照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19
3號：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細胞懸浮液+2ul pUC19
（2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進DNA分子在感受態(tài)細胞表面的吸附。
（3）轉(zhuǎn)入42℃水浴2min，通過熱刺激增強CaCL2的作用，使細胞膜產(chǎn)生通道，便于DNA分子的吸附進入，提高轉(zhuǎn)化率。
（4）迅速轉(zhuǎn)入冰上冷卻2min，修復細胞膜。
（5）加600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37℃，220 rpm，振蕩60min。使受體菌恢復正常生長狀態(tài)，并且表達Ampicillin抗性基因。
（6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺直至液體被吸收，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12－16h后觀察結(jié)果，其余保存于4℃。如果平板上沒有長出菌落，可將之置于37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，同時將剩下的500ul菌液離心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37℃培養(yǎng)。
（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計算轉(zhuǎn)化率。
四、注意事項：
1. 實驗中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA的污染。
2. 實驗過程中要注意無菌操作，溶液移取、分裝等均應在無菌超凈工作臺上進行。
3. 必須設對照組，以檢驗實驗過程中是否有污染。
4. 整個實驗過程均需置于冰上。
5. 選用對數(shù)生長期細胞，OD600不應高于0.6。
