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2012-5-18 閱讀(5607)
一、實(shí)驗(yàn)原理
限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。根據(jù)限制酶的識(shí)別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。其中Ⅱ類酶在分子克隆和基因操作中zui為有用，是常用的分子生物學(xué)工具酶。
限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列長度一般為4～8個(gè)呈回文序列的特異核苷酸對(duì)。一般情況下，識(shí)別序列越長，在同一DNA分子中識(shí)別位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率就越小。許多限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)已被確定。例如EcoRl 酶的識(shí)別與切割序列為以下6個(gè)堿基對(duì)。
5′……GAATTC……3′
3′……CTT AAG…… 5′
EcoR I以*的方式識(shí)別并裂解這個(gè)順序，形成兩個(gè)5′突出末端：
和
……G AATTC……
……CTT AA G……
這些末端為互補(bǔ)的，即粘性末端，并可在連接酶的催化下與由EcoR I產(chǎn)生的其它分子末端相連接。
限制性內(nèi)切酶主要用于基因組DNA的片段化、重組DNA分子的構(gòu)建與鑒定、載體中目的基因片段的分離與回收以及DNA分子物理圖譜的構(gòu)建等。根據(jù)酶切目的和要求不同，可有單酶切、雙酶切或部分酶切等不同方式。根據(jù)酶切反應(yīng)的體積不同，可分為小量酶切反應(yīng)和大量的酶切反應(yīng)。小量酶切反應(yīng)主要應(yīng)用于質(zhì)粒的酶切鑒定，體積為20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反應(yīng)用于制備目的基因片段，體積為50～100 μl，DNA用量在10～30ug。
本實(shí)驗(yàn)為EcoR I對(duì)質(zhì)粒pUC18的小量酶切。 在質(zhì)粒的雙鏈環(huán)狀DNA分子上有多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶酶切位點(diǎn)。在用特定的限制性內(nèi)切核酸酶對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)后，通?？刹捎铆傊悄z電泳進(jìn)行鑒定酶切效果。
二、儀器與試劑
1.儀器：
水浴鍋、離心管、移液器、吸頭、 電泳設(shè)備等。
2.試劑：
質(zhì)粒pUC18、EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶、內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液、瓊脂糖、電泳緩沖液、6×上樣緩沖液、溴化乙啶染液、無菌水等。
三、操作步驟
1．限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.2或0.5ml PCR薄壁離心管中進(jìn)行。
2. 酶切反應(yīng)體系（10ul）：
酶解緩沖液（10×buffer） 1 ul
限制性內(nèi)切酶 0.5 ul EcoR I（7.5U）
底物DNA（質(zhì)粒） x ul（依質(zhì)粒濃度而定）
滅菌ddH2O 加至10 ul
限制性內(nèi)切酶zui后加入，手彈混勻或用吸頭輕輕上下吹吸，混勻后6000 r/min，離心15s。37℃水浴消化2h。
3.酶切完畢，取5ul酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切反應(yīng)效果，必須用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物同時(shí)進(jìn)行電泳以確定DNA的片段的大小。如果酶切不*，可繼續(xù).酶解消化反應(yīng)，或加入適量酶后繼續(xù)反應(yīng)。
5. 經(jīng)電泳觀察酶切反應(yīng)*后，將上述反應(yīng)液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反應(yīng)，將剩余酶切產(chǎn)物保存于?C20℃?zhèn)溆谩?br />
四、注意事項(xiàng)
1.限制性內(nèi)切酶需保存于-20℃，操作時(shí)應(yīng)將酶保持在冰浴中，避免長時(shí)間置于高溫中。
2. 限制性內(nèi)切酶溶液通常含有50%甘油，加入反應(yīng)管后，因密度較大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分搖勻。
3. 加樣時(shí)吸頭垂直進(jìn)入試劑管，避免碰到管壁，每加完一樣要換一個(gè)吸頭，同時(shí)在已加的樣品前做個(gè)記號(hào)以防止錯(cuò)加或漏加，避免污染。
4. 酶（置于冰盒上）應(yīng)zui后加入，盡量減少室溫接觸機(jī)會(huì)。加酶時(shí)吸頭深入不可過深。
5. 酶解消化反應(yīng)溫度及時(shí)間根據(jù)該酶使用說明書而定。
6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA計(jì)算，酶的體積應(yīng)低于反應(yīng)總體積的10%，以避免酶液中甘油干擾反應(yīng) 。酶量過大（≥25U/ug DNA）時(shí)，有產(chǎn)生所謂星號(hào)活性的可能，即在識(shí)別序列以外的位點(diǎn)進(jìn)行切割。此外，反應(yīng)體系中甘油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于12%，以及缺少NACL和存在M等情況下，都有可能出現(xiàn)星號(hào)活性。
五、相關(guān)問題
1.酶的保存
不同的限制酶往往保存在大致相似的緩沖液中，這種特定配方的緩沖液能使酶活性維持較長時(shí)間。常用的保存緩沖液各組分作用如下：
Tris-HCl （7.4―7.8）： 維持穩(wěn)定的pH范圍。
50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的離子強(qiáng)度。
0.1mmol/L EDTA： 絡(luò)合掉能激活限制酶的鎂離子。
1mmol/L DTT： 保護(hù)酶分子上的還原性基團(tuán)。
200-500ug/ml BSA： 牛血清白蛋白提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止蛋白質(zhì)分子濃度過低而導(dǎo)致酶分子變性。
50%的甘油： 使酶液保存于-20℃不至凍結(jié)。
1-5 g/L的Triton-100： 這是一種非離子型表面活性劑，能防止蛋白質(zhì)分子的表面變性作用。
2. 酶單位的定義
限制酶的單位通常定義為：1U的酶能在約50ul合適的反應(yīng)緩沖體系中，在1h內(nèi)完成酶切1ug的λDNA。確定限制酶單位的具體操作方法是分別向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），當(dāng)電泳觀察到酶切片段的條帶不再發(fā)生變化時(shí)說明已作用*，*切割的zui少酶量定為1U的酶量。
3. 限制酶的作用條件
限制酶切割DNA的反應(yīng)中，酶切條件是實(shí)驗(yàn)成功的重要因素，其中包括反應(yīng)的溫度、時(shí)間與反應(yīng)的緩沖體系，除了這些條件外，DNA的純度與濃度也會(huì)影響酶切效果，只有在正確選擇酶反應(yīng)條件時(shí)才能達(dá)到*酶切效果。
（1）作用溫度
早期的酶切反應(yīng)都在37℃進(jìn)行，這種方法雖然簡(jiǎn)單、統(tǒng)一，但卻不能達(dá)到每個(gè)酶的zui適反應(yīng)溫度。為了達(dá)到*酶切的效果，根據(jù)所選用的酶確定所需要的反應(yīng)溫度。
（2）緩沖體系
限制酶反應(yīng)的緩沖體系大致相同，都含有以下組分：約100mmol/L的Tris-HCl，作用是將酶反應(yīng)體系的pH維持在7.5-8.5；約10mmol/L的MgCl2，作用是為限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保護(hù)還原性基團(tuán)；約150mmol/L的NaCl，作用是提供合適的離子強(qiáng)度。由于認(rèn)識(shí)的局限性，早期的限制酶反應(yīng)體系僅根據(jù)其中NaCl含量的不同分為高鹽、中鹽與低鹽三種，這同樣不能使每種酶獲得zui適反應(yīng)條件?，F(xiàn)在提供酶的很多廠商能提供4-10種緩沖體系，其中各必需成分之間只有很小的差別，目的是使每種酶都發(fā)揮zui大的作用。
緩沖液一般配成10倍的濃度，使用時(shí)以1/10的比例加入，當(dāng)然為了減小吸量誤差也可自行配制5倍的緩沖液。
（3） 反應(yīng)體積與時(shí)間
酶反應(yīng)體積一般不宜小于20ul。因?yàn)檫^小的反應(yīng)體積在加入各種成分時(shí)易產(chǎn)生誤差，甘油含量易超過10%。在37℃保溫可因水分蒸發(fā)而明顯改變反應(yīng)體系中各成分的濃度，從而影響酶活力。同時(shí)還要考慮反應(yīng)完畢進(jìn)行電泳時(shí)，所加樣品中DNA的量能夠在電泳中顯出清晰的泳帶。
常規(guī)的酶切反應(yīng)一般控制在60min內(nèi)進(jìn)行，但也可以根據(jù)切割對(duì)象與所用的酶將保溫時(shí)間延長至十幾個(gè)小時(shí)。
（4） DNA的純度與濃度
除了上述酶反應(yīng)條件外，影響酶切效果的zui主要因素是DNA的純度。例如，樣品中含有大量RNA雜質(zhì)時(shí)會(huì)因減少了酶的有效濃度而影響酶切效果；某些雜蛋白未除凈而結(jié)合在DNA時(shí)也會(huì)影響酶切效果。。至于抽提過程中未除凈的各種影響因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是瓊脂糖凝膠中的硫酸根離子等。
DNA純度的另一個(gè)指標(biāo)是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后電泳結(jié)果顯示出不清晰條帶或成為一片紅色（術(shù)語稱Smear）時(shí)，可肯定系統(tǒng)中已經(jīng)污染了DNA酶。
DNA樣品中含有大量RNA時(shí)可用RNA酶處理；含有結(jié)合在DNA上的雜蛋白與DNA酶時(shí)都可用氯仿/異戊醇抽提；當(dāng)樣品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物質(zhì)時(shí)可以通過沉淀更換一個(gè)新的緩沖體系。當(dāng)然，酶切失敗時(shí)也不能排除除DNA外的一切因素，如無菌水，EP管，吸咀等的干凈程度以及內(nèi)切酶自身的酶活性情況。
除純度外，DNA的濃度也會(huì)影響酶切效果，一般DNA質(zhì)量濃度在1ug/20ul才能得到較好的酶切效果，質(zhì)量濃度高達(dá)1.5ug/20ul時(shí)就可能發(fā)生酶切困難。
（5）終止酶切反應(yīng)的方法
如果需對(duì)酶切片段進(jìn)行連接或標(biāo)記等操作時(shí)，首先要將限制酶滅活。滅活的方法可分為三種：*種是向反應(yīng)緩沖體系中加入終濃度為10-12.5mmol/L的EDTA，原理是絡(luò)合掉酶反應(yīng)中所需的鎂離子。但這種方法會(huì)影響需鎂離子的后續(xù)反應(yīng)。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法來更換緩沖體系，以除去EDTA，但這樣就會(huì)造成DNA的損失。第二種方法是熱失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保溫60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保溫30min方能達(dá)到目的；的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加熱的方法使之失活。熱失活方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單并且未向體系中引入任何物質(zhì)，特別適用于連續(xù)進(jìn)行幾個(gè)酶切反應(yīng)；熱失活法的另一個(gè)特點(diǎn)是不用更換體系，所以不會(huì)造成DNA的損失。第三種方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA的片段。這種方法的特點(diǎn)是處理?xiàng)l件劇烈，能使酶*失活（不像*種方法中酶蛋白并未變性而只是沒有激活因子而已）。
