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細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法
閱讀：2471 發(fā)布時(shí)間：2019-11-18一、目的
學(xué)習(xí)原代培養(yǎng)方法，從供體取得組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的培養(yǎng)。
二、概述
組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法?？梢圆捎眉羟蟹?，即將組織塊剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，組織小塊貼壁24h或更長(zhǎng)時(shí)間后，細(xì)胞就從組織四周游出。但由于在反復(fù)剪切和接種過(guò)程中對(duì)組織塊的損傷，并不是每個(gè)小塊都能長(zhǎng)出細(xì)胞。用于組織塊培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶可根據(jù)不同細(xì)胞生長(zhǎng)的需要作適當(dāng)處理，如預(yù)先涂以膠原薄層，以利于上皮樣細(xì)胞等的生長(zhǎng)。（本節(jié)以新生牛主動(dòng)脈平滑肌培養(yǎng)為例）
三、材料
（一）儀器
1.凈化工作臺(tái)
2.恒溫水浴箱
3.冰箱（4℃、-20℃）
4.倒置相差顯微鏡
5.培養(yǎng)箱
（二）玻璃器皿
1.培養(yǎng)皿（Φ100mm）
2.吸管（彎頭）
3.燒杯（500ml、200ml、10ml）
4.廣口試劑瓶（500ml）
5.玻璃瓶（250ml、100ml）
6.培養(yǎng)瓶
7.廢液缸
（三）塑料器皿
1.吸頭
2.槍頭
3.膠塞
4.EP管
（四）其他物品
1.微量加樣槍
2.眼科組織剪（直尖、彎）
3.眼科組織鑷（直、彎）
4.12.5cm組織鑷（無(wú)鉤、1×2鉤）
5.25cm敷料鑷（無(wú)鉤）
6.止血鉗（18cm直紋式、12.5cm直紋式、彎紋式）
7.解剖剪
（五）試劑
1.D-Hanks液
2.小牛血清
3.RPMI1640
4.雙抗（青霉素、鏈霉素）
5.1N HCl
6. 7.4%NaHCO3
四、操作步驟
1.取材：打開(kāi)胸腔，無(wú)菌操作下取出主動(dòng)脈胸段，浸到預(yù)先配制好的含雙抗（500u/ml青、鏈酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.組織的沖洗、修剪：取出主動(dòng)脈，用鋒利的剪刀修剪除去周?chē)M織，再用D-Hanks沖洗主動(dòng)脈3次，除去血kuai及雜組織等。
3.平滑肌組織分離：縱向剖開(kāi)主動(dòng)脈，撕下主動(dòng)脈內(nèi)層，取主動(dòng)脈中層的平滑肌組織，無(wú)血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：將平滑肌組織用鋒利的眼科剪反復(fù)剪切至剪成1mm3小塊，在剪切過(guò)程中，可以適當(dāng)向組織中滴加1～2滴培養(yǎng)液，以保持濕潤(rùn)。
5.貼塊：將剪切好的組織小塊，用眼科鑷送入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用彎頭吸管將組織塊均勻擺置，每小塊間距0.5cm左右，組織塊放置好后，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上，向瓶?jī)?nèi)注入適量含10%牛血清培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋。
6.培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶瓶底朝上，37℃培養(yǎng)箱放置2～4h，待組織小塊貼附后，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。
7.換液：原代培養(yǎng)3～5d，需換液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞。
組織塊培養(yǎng)法也可不用翻轉(zhuǎn)法，即在擺放組織塊后，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)僅加入少量培養(yǎng)液，以能保持組織塊濕潤(rùn)即可，蓋好瓶蓋，放置37℃培養(yǎng)箱24h再補(bǔ)加培養(yǎng)液。
注意事項(xiàng)
1.取材的組織盡快培養(yǎng)。因故不能即時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4℃冰箱中，如果組織塊很大，應(yīng)切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過(guò)24h。
2.從消化道、周?chē)袎乃澜M織等污染因素存在的區(qū)域取材，可用含500～1000u/ml的青、鏈霉素BSS液漂洗5～10min，或用10%達(dá)克寧注射液沖洗浸泡10min再作培養(yǎng)。
3.組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶壁涂薄層血清、胎汁或鼠尾膠等。
4.原代培養(yǎng)的1～2d內(nèi)要特別注意觀察是否有細(xì)菌、霉菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除。