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小鼠白介素-6ELISA試劑盒檢測(cè)過(guò)程
閱讀：1672 發(fā)布時(shí)間：2013-3-13 規(guī)格96T
前言簡(jiǎn)介
白介素6是一種細(xì)胞因子,已被證實(shí)為B細(xì)胞分化因子.它是一種抗體形成系統(tǒng),它的生理特性,如肝細(xì)胞急性蛋白合成的誘導(dǎo)和基于和白介素3協(xié)同作用的生長(zhǎng)激等,也備受關(guān)注. 并且已證實(shí)白介素-6與病理學(xué)存在穩(wěn)定的相關(guān)關(guān)系.例如,報(bào)道多種疾病的生長(zhǎng)因子為白介素-6, 骨髓瘤細(xì)胞能合成白介素-6并表達(dá)白介素-6受體.此外, 白介素6在多種炎性疾病和自身免疫疾病發(fā)揮重要的作用. 此試劑盒能高靈敏度的檢測(cè)小鼠血清和細(xì)胞基質(zhì)上清的白介素6 原理 此試劑盒運(yùn)用了兩種特異性抗體,洗板后加入TMB底物液顯色,顯色的強(qiáng)度與小鼠的白介素-6的量成正比. 檢測(cè)范圍 10.94 700 pg/mL
預(yù)期用途
■此IBL試劑盒能用于小鼠血清,EDTA血漿,細(xì)胞上清中白介素-6的定量檢測(cè)
試劑盒成分
1 預(yù)包被板: 抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 96T
2 酶標(biāo)記抗體: （30倍濃縮）HRP標(biāo)記抗小鼠白介素-6兔子IgG,親合純化 0.4mL x 1
3 標(biāo)準(zhǔn)品: 重組小鼠白介素-6 0.5mL x 2
4 EIA緩沖液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1
5 標(biāo)記抗體稀釋液: 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1
6 顯色劑: TMB底物液 15mL x 1
7 終止液: 1N硫酸 12mL x 1
8 濃縮洗滌液: （40倍濃縮） 含1% BSA, 0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1 操作說(shuō)明 1實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒沒有提供） 酶標(biāo)儀（450nm） 微移液管及其吸嘴 量筒及燒杯 去離子水 冰箱（4°C） 坐標(biāo)紙（log/log） 吸水紙 試管（用于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋） 溫育箱（37°C ± 1°C） 洗瓶 （用于洗板） 一次性試劑管（用于濃縮酶標(biāo)記抗體和顯色劑）
2準(zhǔn)備
1） 洗滌液的準(zhǔn)備 試劑盒的洗滌液是一種40倍濃縮液,用1950 mL去離子水稀釋50 mL的濃縮洗滌液,制成2000mL即用稀釋洗滌液. 置于冰箱內(nèi)可保存2周.
2） 酶標(biāo)記抗體的準(zhǔn)備 試劑盒中的標(biāo)記抗體是一種30倍濃縮物,根據(jù)所需量,用標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30倍. 示例: 如果你用一條板（8孔）,就需800 μL.的標(biāo)記抗體.就用870 μL的標(biāo)記抗體稀釋液稀釋30 μL抗體濃縮液,充分混勻.并每孔各加100 μL 濃縮酶標(biāo)記抗體需稀釋后才能用于實(shí)驗(yàn) 剩余的稀釋標(biāo)記抗體液需密封瓶裝,存于4°C
3） 標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)備 加0.5 mL的去離子水到瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品,制成濃度為1,400 pg/mL小鼠白介素-6標(biāo)準(zhǔn)品液
4） 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋 準(zhǔn)備8支試管,并每支各加230 μL EIA緩沖液.稀釋成如下濃度,
步驟如下圖所示: 試管1 700 pg/mL 試管2 350 pg/mL 試管3 175 pg/ mL 試管4 87.5 pg/mL 試管5 43.75 pg/mL 試管6 21.88 pg/mL 試管7 10.94pg/mL 試管8 0 pg/mL（樣品空白對(duì)照） 吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品液于1號(hào)管混勻然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管混勻如下圖所示,按此規(guī)律稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為10.94-700 pg/mL,第8號(hào)管為0 pg/mL作為樣品空白對(duì)照
5） 樣品稀釋 樣品如需稀釋時(shí),必須用EIA緩沖液進(jìn)行稀釋 如果樣品中小鼠白介素-6的濃度范圍一無(wú)所知的話,預(yù)先準(zhǔn)備幾個(gè)不同稀釋濃度的樣品液來(lái)確定*的檢測(cè)濃度.
3實(shí)驗(yàn)步驟 使用前將所有試劑應(yīng)平衡至室溫大約30min充分混勻確保試劑質(zhì)量無(wú)改變標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測(cè)必須同時(shí)進(jìn)行. 試劑 待檢測(cè)樣品 標(biāo)準(zhǔn)品 樣品空白 試劑空白 檢 測(cè) 樣 品100ul 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品1-7管100ul EIA緩沖液第8管 100ul EIA緩沖液100ul 蓋板于4°C下溫育過(guò)夜 洗板7次 酶標(biāo)抗體 100ul 100ul 100ul - 蓋板于4°C下溫育30min 洗板9次 顯色劑 100ul 100ul 100ul 100ul 室溫避光溫育30min 終止液 100ul 100ul 100ul 100ul 加終止液后,30min內(nèi)于450nm處讀取OD值
1 設(shè)試劑空白對(duì)照并于相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液
2 確定好樣品空白對(duì)照孔檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔分別將100ul樣品對(duì)照品（8號(hào)管）、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品（1-7號(hào)管）加入到相應(yīng)的微孔中。
3 蓋板4°C下溫育過(guò)夜
4 用洗滌瓶劇烈洗板,再加入稀釋洗滌液,靜置15-30秒,再*倒去孔內(nèi)反應(yīng)液 重復(fù)洗板7次. zui后在吸水紙上拍干,去除殘留液滴 如用自動(dòng)洗板機(jī)洗板,先自動(dòng)洗4次,再按上述用洗瓶手工洗3次
5 除試劑空白對(duì)照孔外,其余每孔各加100ul酶標(biāo)抗體
6 蓋板4°C下溫育30min
7 按照上述步驟4洗板9次
8 用一次性試管取所需量的顯色劑各加100ul顯色劑于微孔中.為了避免污染勿將剩余試劑在倒回試劑瓶中
9 室溫避光溫育30min加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色
10每孔各加100ul終止液溶液顏色會(huì)變成黃色
11擦去微孔板底部的污跡或水滴確保微孔內(nèi)溶液無(wú)氣泡產(chǎn)生.加入終止液后30min內(nèi)于酶標(biāo)儀 450nm處讀取結(jié)果 特別注意
1） 收集樣品后即盡快檢測(cè). 如需保存, 凍存樣品,但要避免反復(fù)凍融.檢測(cè)前,將樣品解凍至室溫
2） 如樣品需稀釋,用EIA緩沖液稀釋
3） 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品建議做雙份檢測(cè)
4） 保持樣品處于中性PH范圍.有機(jī)溶劑的污染會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5） 只能用本試劑盒提供的洗滌液洗板.不充足的洗板會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果 6） 在吸水紙上拍干去除殘留液滴時(shí),切勿用吸水紙刮擦孔內(nèi)壁
7） 顯示劑應(yīng)避光保存并避免與金屬物質(zhì)接觸
8） 加終止液后,30 min內(nèi)就應(yīng)讀取實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果計(jì)算 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（包括標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)樣品的OD值）,都應(yīng)減去樣品空白對(duì)照的OD值. 在log-log坐標(biāo)紙用,以較正的OD值為縱坐標(biāo),相對(duì)應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線. 樣品直接在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲取濃度值.
每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)建立其標(biāo)準(zhǔn)曲線. 使用及處理常規(guī)事項(xiàng)
1所有試劑置于2 - 8°C保存.實(shí)驗(yàn)前將試劑平衡至室溫（約30分鐘）
2瓶裝標(biāo)準(zhǔn)品是凍干品,故小心打開瓶蓋
3終止液是強(qiáng)酸物質(zhì).使用時(shí),避免其接觸皮膚和衣膚
4棄置用過(guò)的物質(zhì)前,用水沖洗
5 濃縮酶標(biāo)抗體,EIA緩沖液和濃縮洗滌液可能會(huì)出現(xiàn)沉淀,但這并不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)
6使用試劑后應(yīng)洗手
7切勿混用不同批號(hào)的試劑
8別使用過(guò)期的試劑
9試劑盒僅供研究用,不能用于臨床診斷 存儲(chǔ)與有效期 存儲(chǔ)條件: 2 - 8°C 有效期見試劑盒外包裝
本譯文僅供參考詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。