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恒遠實驗，一氧化氮合酶組織化學染色法的原理與過程
閱讀：629 發(fā)布時間：2014-3-26| 提 供 商 | 上海恒遠生物科技有限公司 | 資料大小 | 67KB |
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一氧化氮合酶是一種連接酶，能催化前體物質L精氨酸L瓜氨酸和一氧化氮(NO)。NO是中樞和外周神經系統(tǒng)中的一種神經遞質，活細胞間信使和內皮源性松弛血管的介質，在神經、心血管及免疫系統(tǒng)中有廣泛的作用。NO極不穩(wěn)定。易于擴散游離，半衰期短，不易檢測。因NOS是合成NO的關鍵酶，故通常通過檢測NOS的活性來評估NO的分布和功能。NOS有3種異構型，即神經型NOS、內皮型NOS和細胞因子誘導型NOS。由于還原型輔酶Ⅱ—黃遞酶與NOS在化學結構和組織定位上有*的一致性，且也與NO密切相關．故人們常采用NADPH-黃遞酶法來顯示NOS活性。
1、原理：在βNADPH存在下，NOS的C末端能將NADPH電子轉移到NBT，將NBT還原成不溶性藍紫色甲臘沉淀產物。
2、孵育液配制
β—NADPH 10mg
NBT 5mg
Triton X—100 0．03ml
0．05mol/L TB(pH 8．0) 9．97ml
臨用前配制。
3、染色程序
① 固定：4％多聚甲醛(0．1mol/LPBS配制)灌流固定，取材后入同樣固定液再固定1小時(4℃)，20％蔗糖中4℃放置一個晚上；
② 冰凍切片：厚10—401．Lm；
③ 孵育：切片人孵育液中37％孵育30分鐘～1小時；
④ 終止反應：切片人0．05mol/LTB或蒸餾水中；分鐘；
⑤ 常規(guī)脫水、透明、封片或直接用甘油明膠封片。
4、結果與評價
反應產物為藍色或藍紫色沉淀。NADPH-黃遞酶法顯示NOS活性，方法簡便經濟，應用廣泛，但不能區(qū)分NOS亞型。
5、
在孵育液對照實驗中除去β—NADPH或用0．1mol/L N—亞硝基精氨酸(NOS抑制劑)預孵育切片1小時，結果應為陰性。