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ELISA預(yù)實(shí)驗完整攻略
閱讀：446 發(fā)布時間：2024-11-27ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）預(yù)實(shí)驗是開展正式實(shí)驗前不可少的環(huán)節(jié)，主要用于摸索合適的實(shí)驗條件及確定實(shí)驗的可行性。以下是ELISA預(yù)實(shí)驗的開展過程，一起來看看吧！
一、預(yù)實(shí)驗的目的
確定實(shí)驗條件：如抗原或抗體的濃度、酶的種類和濃度、洗滌液的濃度和pH值等，以確保實(shí)驗的準(zhǔn)確性和可靠性。
確定實(shí)驗范圍：包括最佳反應(yīng)時間和濃度范圍，以確保在正式實(shí)驗中獲得最佳的實(shí)驗結(jié)果。
驗證實(shí)驗方法：確保實(shí)驗方法的準(zhǔn)確性和可靠性。
減少實(shí)驗誤差：提高實(shí)驗的重復(fù)性和可重復(fù)性。
二、預(yù)實(shí)驗的方法
1.實(shí)驗樣本的選擇：
預(yù)實(shí)驗一般通過測定少數(shù)有代表性的樣本來確定正式實(shí)驗方案。通常，測定的樣本會分為不同的組別，不同組別的樣本由于前期處理或刺激后，靶標(biāo)物的表達(dá)量會產(chǎn)生變化。建議從各組樣本中隨機(jī)選擇1~2例樣本。如果正式實(shí)驗測定的樣本數(shù)量多，分配到預(yù)實(shí)驗的試劑量有限，那么至少選擇兩例樣品，建議選用1例為理論上靶標(biāo)物含量zui低組的樣品，另1例為理論上靶標(biāo)物含量最高組的樣品。
2.最適稀釋倍數(shù)的確定：
①將樣本梯度稀釋，可根據(jù)樣本中靶標(biāo)物的濃度，選擇2倍、5倍或10倍梯度稀釋，同時測定標(biāo)準(zhǔn)品。
②標(biāo)準(zhǔn)品的制備需按照試劑盒說明書的要求，試劑量充足可以選擇一條完整的標(biāo)曲，試劑量有限也可以選擇部分濃度點(diǎn)（如空白孔、zui低濃度孔、中間濃度孔以及最高濃度孔）。
③將測定的不同稀釋濃度的樣本測定的OD值（光密度值）與梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值進(jìn)行對比，最佳稀釋倍數(shù)為此倍數(shù)稀釋后全部或絕大多數(shù)樣本OD值能夠位于標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度孔對應(yīng)的OD值，即標(biāo)準(zhǔn)曲線的最佳擬合區(qū)域。
④在做預(yù)實(shí)驗時，一定要設(shè)置標(biāo)曲，不設(shè)置標(biāo)曲則無法通過比較確定最適稀釋倍數(shù)。
3.抗原包被濃度的設(shè)定：
①將抗原溶液分別按照1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的濃度稀釋在抗原包被液中。
②以等量隨機(jī)選取的特異性抗體血清與抗原溶液反應(yīng)，在37℃孵育1小時后清洗，然后加酶標(biāo)二抗，孵育30分鐘清洗，zui hou加底物顯色，反應(yīng)終止后用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定各孔的光密度值。
③繪制ROC曲線（受試者工作特征曲線），找出臨界值。
4.酶標(biāo)二抗稀釋比例的確定：
①取已知陽性和陰性血清樣本，分別用ELISA稀釋液將特異性抗體稀釋成不同濃度的酶標(biāo)二抗溶液，與包被抗原孵育、清洗后加底物顯色，zui hou用酶標(biāo)儀測定光密度值。
②繪制ROC曲線，找出臨界值。
5.顯色時間的確定：
①顯色是ELISA實(shí)驗中zui hou一步溫育反應(yīng)，固定在酶標(biāo)板上的酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物。
②由于ELISA實(shí)驗會受到環(huán)境差異及實(shí)驗操作差異的影響，商業(yè)化的ELISA試劑盒通常不會推薦固定的顯色時間，而是建議實(shí)驗操作人員根據(jù)顯色情況判斷合適的顯色反應(yīng)時間。
③加入底物后可定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（如每隔5分鐘觀察一次），當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3~4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3~4孔梯度不明顯時，即可終止。通過預(yù)實(shí)驗熟悉操作的同時，也能確定合適的顯色時間。
三、注意事項
①在進(jìn)行預(yù)實(shí)驗時，應(yīng)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作，避免由于操作不當(dāng)導(dǎo)致的實(shí)驗誤差。
②預(yù)實(shí)驗的結(jié)果應(yīng)認(rèn)真記錄和分析，以便為正式實(shí)驗提供可靠的依據(jù)。
③在預(yù)實(shí)驗過程中，如發(fā)現(xiàn)任何異?；虿环项A(yù)期的結(jié)果，應(yīng)及時查找原因并進(jìn)行調(diào)整。
通過以上預(yù)實(shí)驗的設(shè)置和操作，可以對ELISA實(shí)驗的條件進(jìn)行初步的摸索和優(yōu)化，為后續(xù)的正式實(shí)驗提供可靠的基礎(chǔ)。同時，也能及時發(fā)現(xiàn)實(shí)驗中存在的問題，進(jìn)行針對性的改進(jìn)，提高實(shí)驗的準(zhǔn)確性和可靠性。上海恒遠(yuǎn)生物專業(yè)提供生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)服務(wù)，提供實(shí)驗技術(shù)服務(wù)，為廣大科研工作者大大節(jié)省了重復(fù)勞動的時間和精力，我們有過硬的技術(shù)咨詢和完善的售后服務(wù)，購買ELISA試劑盒贈送免費(fèi)代測服務(wù)，在線一對一技術(shù)指導(dǎo)，為您解決后顧之憂。